WGBS等研究揭示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A調(diào)控端粒酶活性的非經(jīng)典功能

2025年8月7日，美國(guó)圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Grant A.Challen 團(tuán)隊(duì)在《Cell Stem Cell》期刊發(fā)表題為“Non-canonical functions of DNMT3A in hematopoietic stem cells regulate telomerase activity and genome intergrity”（DNMT3A調(diào)控造血干細(xì)胞的端粒酶活性和基因組完整性的非經(jīng)典功能）的重要研究文章。

研究通過構(gòu)建DNA甲基化功能喪失但蛋白結(jié)構(gòu)完整的Dnmt3a點(diǎn)突變小鼠模型（E752A、V712G、R832A突變），結(jié)合體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)、連續(xù)骨髓移植、全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）及端粒功能分析等研究，系統(tǒng)揭示了DNMT3A在造血干細(xì)胞（HSC）中存在不依賴于其DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的非經(jīng)典功能，核心結(jié)論為Dnmt3a缺失的HSC通過上調(diào)端粒酶活性、維持端粒長(zhǎng)度并抑制DNA損傷應(yīng)答（DDR），實(shí)現(xiàn)無限移植傳代，而保留催化缺失蛋白的HSC則無法長(zhǎng)期維持該優(yōu)勢(shì)。綜上，這些發(fā)現(xiàn)闡明了DNMT3A在HSCs中具有不依賴于其經(jīng)典甲基化功能的、調(diào)控端粒穩(wěn)態(tài)和基因組完整性的“非經(jīng)典”作用，為理解克隆性造血（CH）和白血病中DNMT3A突變的作用機(jī)制提供了全新視角。

英文標(biāo)題：Non-canonical functions of DNMT3A in hematopoietic stem cells regulate telomerase activity and genome intergrity
中文標(biāo)題：DNMT3A調(diào)控造血干細(xì)胞的端粒酶活性和基因組完整性的非經(jīng)典功能
發(fā)表時(shí)間：2025-8-7
發(fā)表期刊：Cell Stem Cell
影響因子：IF20.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq等
作者單位：美國(guó)圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院
DOI:10.1016/j.stem.2025.06.010

DNMT3A是造血干細(xì)胞（HSC）命運(yùn)決定的關(guān)鍵調(diào)控因子，也是人類克隆性造血（CH）中最常突變的基因。DNMT3A作為一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，在先前研究中，DNMT3A功能喪失細(xì)胞僅表現(xiàn)出輕度DNA甲基化變化，且與基因表達(dá)變化不相關(guān)。為探索Dnmt3a在HSC中是否具有DNA甲基化非依賴性功能，研究人員構(gòu)建了多個(gè)DNA甲基化功能喪失不同程度的Dnmt3a等位基因突變小鼠模型。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化功能喪失的Dnmt3a蛋白可以挽救Dnmt3a缺失型HSC的克隆擴(kuò)增，表明Dnmt3a在HSC中具有重要的非經(jīng)典功能。Dnmt3a缺失型HSC能夠無限期移植，表明其能規(guī)避抑制HSC復(fù)制壽命的機(jī)制（如端�？s短）。Dnmt3a缺失型HSC顯示出增強(qiáng)的端粒酶活性，并在連續(xù)移植中維持端粒長(zhǎng)度，揭示了DNMT3A突變?cè)谡{(diào)控HSC壽命中與DNA甲基化功能無關(guān)的全新作用。

研究亮點(diǎn)

• 構(gòu)建小鼠模型以研究Dnmt3a不依賴DNA甲基化的功能
• Dnmt3a介導(dǎo)的DNA甲基化對(duì)造血干細(xì)胞分化至關(guān)重要，但對(duì)自我更新并非必需
• Dnmt3a調(diào)控造血干細(xì)胞中端粒酶的表達(dá)和活性
• 在端粒酶缺失情況下，Dnmt3a影響造血干細(xì)胞中的DNA損傷應(yīng)答信號(hào)

圖形摘要

研究方法
（1）小鼠模型構(gòu)建：

• 構(gòu)建條件性敲除（Dnmt3afl/fl），催化失活點(diǎn)突變（催化死亡/0%甲基化活性的Dnmt3aE752A、活性30%的Dnmt3aV712G和靶標(biāo)識(shí)別缺陷/20%活性的Dnmt3aR832A），Dnmt3a/Terc雙敲除（DTKO）模型。

（2）造血干細(xì)胞功能學(xué)分析：

• 連續(xù)骨髓移植：評(píng)估HSCs長(zhǎng)期自我更新和重建能力。
• 集落形成單位（CFU）實(shí)驗(yàn)：體外評(píng)估HSCs/祖細(xì)胞增殖功能。
• 流式細(xì)胞術(shù)分析與分選：精確分選和鑒定HSCs（Lin- Sca-1+ c-Kit+ CD48- CD150+）及其他造血細(xì)胞群體，并分析細(xì)胞凋亡（Annexin V）、細(xì)胞周期（Ki-67/DAPI）和DNA損傷（γH2AX）。

（3）分子機(jī)制分析

• 全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）：在全基因組單堿基分辨率水平上，系統(tǒng)比較不同基因型HSCs和骨髓細(xì)胞的DNA甲基化圖譜，是本研究核心的甲基化分析技術(shù)。
• RNA測(cè)序（RNA-seq）與qPCR：分析轉(zhuǎn)錄組變化和特定基因（如Tert, Terc）的表達(dá)。

（4）端粒功能分析

• 端粒限制性片段（TRF）分析：檢測(cè)端粒DNA片段的大小分布，反映平均端粒長(zhǎng)度。
• 端粒酶活性檢測(cè)（TRAP法）：定量檢測(cè)端粒延伸產(chǎn)物，定量端粒酶活性。
• 端粒熒光原位雜交（TelC FISH）：定量檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的端粒信號(hào)強(qiáng)度。

（5）DNA損傷與ALT分析：

• 彗星試驗(yàn)分析全局DNA損傷。
• 免疫熒光共定位（53BP1/TRF1）檢測(cè)端粒功能障礙誘導(dǎo)的灶（TIF）。
• C-circle檢測(cè)和APB（ALT相關(guān)PML核體）分析評(píng)估替代性端粒延長(zhǎng)（ALT）通路。
  （6）蛋白表達(dá)及互作分析：通過免疫共沉淀（Co-IP）研究Dnmt3a與組蛋白伴侶SPT16的相互作用。
• 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）：分析目標(biāo)蛋白（如Dnmt3a, γH2AX, SPT16）的表達(dá)水平。
• 免疫共沉淀（Co-IP）：研究Dnmt3a與潛在互作蛋白（如SPT16）的互作及其藥物干預(yù)下的變化。

結(jié)果圖形
（1）Dnmt3a在造血中存在非DNA甲基化依賴性功能的證據(jù)
研究團(tuán)隊(duì)首先通過過表達(dá)實(shí)驗(yàn)揭示Dnmt3a存在區(qū)別于其傳統(tǒng)甲基化酶活性的功能。由于DNMT3L（可增強(qiáng)Dnmt3a甲基化活性的輔助因子）在HSC中不表達(dá)，研究團(tuán)隊(duì)在野生型和Dnmt3a敲除（Dnmt3aKO）HSPC中分別異位表達(dá)Dnmt3L，觀察到Dnmt3L僅在野生型背景下抑制移植嵌合率，而在Dnmt3aKO細(xì)胞中無影響（圖1C-E），說明其功能依賴Dnmt3a。更重要的是，過表達(dá)野生型Dnmt3a對(duì)野生型和Dnmt3aKO HSPC均產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致移植后細(xì)胞快速凋亡（圖1B、F），而Dnmt3L過表達(dá)雖引起更顯著的DNA高甲基化（圖1G-H），卻未產(chǎn)生同等毒性，表明Dnmt3a的某些調(diào)控作用不依賴于其催化活性。WGBS分析顯示，Dnmt3a過表達(dá)僅引起輕度甲基化改變，而Dnmt3L導(dǎo)致數(shù)千個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMRs）高甲基化，但表型差異卻顯著差異，這表明Dnmt3a功能不能簡(jiǎn)單直接等同于其甲基化活性，可能存在獨(dú)立于催化的非經(jīng)典功能。

圖1：Dnmt3a在造血中DNA甲基化非依賴性功能的證據(jù)

（2）DNA甲基化功能喪失的Dnmt3a蛋白可挽救Dnmt3a缺失HSCs的功能變化
為直接驗(yàn)證非經(jīng)典功能，研究者利用慢病毒在Dnmt3aKO HSC中挽救表達(dá)野生型或催化缺失型Dnmt3a點(diǎn)突變體（E752A、V712G、R832A）。分析結(jié)果表明，在Dnmt3aKO HSCs中挽救這些甲基化功能受損的突變蛋白，能夠像挽救野生型Dnmt3a一樣，抑制其增強(qiáng)的CFU形成能力，且所有三種催化缺陷變體同樣能有效挽救CFU異常（圖2A），但并未介導(dǎo)全基因組DNA甲基化顯著增加（圖2B）。這直接證明，挽救Dnmt3aKO HSCs異常增殖表型的功能，不依賴于Dnmt3a的DNA甲基化催化活性。

體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)中，全骨髓細(xì)胞移植顯示Dnmt3aE752A/E752A和Dnmt3aR832A/R832A HSC在二次移植后逐漸衰竭，而Dnmt3aKO HSC持續(xù)擴(kuò)增（圖2C-E），提示甲基化非依賴功能雖能短期調(diào)控HSC活性，但長(zhǎng)期維持克隆優(yōu)勢(shì)需完全喪失Dnmt3a蛋白。

圖2：DNA甲基化功能喪失的Dnmt3a蛋白挽救Dnmt3a缺失型造血干細(xì)胞的功能改變

（3）DNA甲基化缺失型Dnmt3a可挽救Dnmt3a缺失HSCs在連續(xù)移植中的克隆擴(kuò)增
為在體內(nèi)驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)在成年小鼠中誘導(dǎo)表達(dá)純合或雜合的催化失活Dnmt3a突變蛋白（Δ/E752A, Δ/R832A）。在連續(xù)競(jìng)爭(zhēng)性移植實(shí)驗(yàn)中，完全缺失Dnmt3a（Δ/Δ）的HSCs表現(xiàn)出經(jīng)典且持續(xù)的克隆擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)，但在表達(dá)催化失活突變體（Δ/E752A, Δ/R832A）的HSCs中，其過度自我更新的表型被顯著抑制，功能上更接近于野生型或雜合缺失（Δ/+）的HSCs（圖3A-C）。這再次證明Dnmt3a調(diào)控HSCs自我更新的關(guān)鍵功能不依賴于其DNA甲基化活性。

值得注意的是，WGBS分析顯示Dnmt3aΔ/E752A與Dnmt3aΔ/Δ細(xì)胞的甲基化譜幾乎完全重疊。此結(jié)果強(qiáng)烈證明，HSC的長(zhǎng)期克隆擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)與DNA甲基化狀態(tài)（催化活性喪失）不相關(guān)，而完全依賴于Dnmt3a蛋白的缺失。細(xì)胞周期和凋亡分析排除這些差異源于增殖或存活率變化（圖3D-E），證實(shí)功能差異主要?dú)w因于其內(nèi)在自我更新機(jī)制變化。

圖3：DNA甲基化功能喪失的Dnmt3a挽救連續(xù)移植中Dnmt3a缺失型造血干細(xì)胞的克隆擴(kuò)增

（4）DNA甲基化與基因表達(dá)和功能輸出不相關(guān)
研究者對(duì)來自連續(xù)移植后的不同基因型HSCs和骨髓細(xì)胞進(jìn)行了單堿基分辨率的全基因組甲基化測(cè)序分析（WGBS）。分析結(jié)果顯示，Dnmt3aΔ/E752A（催化失活）細(xì)胞的整體甲基化譜與Dnmt3a Δ/Δ（完全缺失）細(xì)胞幾乎完全重疊，而與野生型細(xì)胞顯著不同（圖4A-F）。其中主成分分析（PCA）顯示，在Dnmt3aKO細(xì)胞中的差異甲基化區(qū)域（DMRs），Dnmt3aΔ/E752A細(xì)胞也表現(xiàn)出幾乎一致的甲基化水平（圖4C, F）。然而，與幾乎完全一致的甲基化圖譜形成鮮明對(duì)比的是，這些基因型在HSC功能（自我更新）和基因表達(dá)譜上存在顯著差異。RNA-seq分析顯示，Δ/E752A和Δ/R832A HSCs的轉(zhuǎn)錄組更接近于野生型，而與Δ/Δ HSCs存在顯著差異（圖4G, H）。

研究通過整合WGBS與RNA-seq數(shù)據(jù)，系統(tǒng)論證了DNA甲基化變化不能預(yù)測(cè)HSC功能潛力，甲基化非依賴的蛋白-蛋白互作或染色質(zhì)調(diào)控才是驅(qū)動(dòng)表型的核心機(jī)制，為研究領(lǐng)域長(zhǎng)期存在的"甲基化悖論"提供了決定性證據(jù)。

圖4：造血干細(xì)胞的DNA甲基化譜與基因表達(dá)及功能輸出無關(guān)

（5）DNMT3A功能喪失增強(qiáng)TERT表達(dá)和端粒酶活性
研究者觀察到Dnmt3aKO HSCs能夠進(jìn)行無限期連續(xù)移植，提示其可能規(guī)避了限制HSC復(fù)制壽命的機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)聚焦端粒調(diào)控機(jī)制。TRF Southern blot分析和TelC FISH證實(shí)，Dnmt3aKO骨髓細(xì)胞和HSPCs的端粒長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，且在連續(xù)移植中得以維持（圖5A-C）。qPCR和TRAP實(shí)驗(yàn)揭示，Dnmt3aΔ/Δ細(xì)胞Tert mRNA表達(dá)增加3倍，端粒酶活性顯著升高（圖5D-E）。重要的是，這種端粒酶的上調(diào)也出現(xiàn)在催化失活的Δ/E752A和Δ/R832A HSCs中（圖5G-H），并且這些細(xì)胞的端粒在短期（二次）移植后也出現(xiàn)延長(zhǎng)（圖5I），然而在長(zhǎng)期移植（四次）后，E752A和R832A組端粒長(zhǎng)度不及Dnmt3aΔ/Δ組（圖5J），提示短期端粒酶激活可能依賴甲基化非直接機(jī)制（如轉(zhuǎn)錄調(diào)控），而長(zhǎng)期維持需完全蛋白缺失以激活替代性端粒延長(zhǎng)（ALT）通路。

圖5：DNMT3A功能喪失會(huì)增強(qiáng)TERT表達(dá)和端粒酶活性

（6）Dnmt3a功能喪失可部分挽救端粒酶缺失HSCs的功能
為了探究端粒酶上調(diào)是否是Dnmt3aKO HSCs功能優(yōu)勢(shì)的原因，研究者構(gòu)建了Dnmt3a與Terc（端粒酶RNA組分）雙敲除（DTKO）小鼠。在連續(xù)移植中，單純的TercKO HSCs由于端�？焖倏s短，其重建功能急劇減弱，但DTKO HSCs的移植能力得到了顯著的部分挽救（圖6A-D）。

有趣的是，盡管DTKO細(xì)胞缺乏端粒酶活性（圖6F），但其端粒在連續(xù)移植后仍被延長(zhǎng)（圖6E），并出現(xiàn)了替代性端粒延長(zhǎng)（ALT）通路標(biāo)志物C-circle和APBs（圖6I-K）。這表明，在端粒酶缺失的情況下，Dnmt3a缺失能夠激活A(yù)LT通路來維持端粒長(zhǎng)度，從而部分補(bǔ)償端粒酶功能。

圖6：Dnmt3a功能喪失部分挽救端粒酶缺失HSCs的功能缺陷

（7）Dnmt3a缺失抑制功能失調(diào)端粒處的DNA損傷應(yīng)答
端粒功能障礙會(huì)激活DNA損傷應(yīng)答（DDR），導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在TercKO HSCs中，DDR標(biāo)志物γH2AX水平、端粒功能障礙誘導(dǎo)灶（TIF）以及凋亡均顯著增加。而同時(shí)缺失Dnmt3a（DTKO）能顯著抑制這些DDR信號(hào)的激活（圖7A-F）。彗星試驗(yàn)也表明DTKO細(xì)胞的整體DNA損傷少于TercKO細(xì)胞（圖7G-H）。

此外，在基因毒性藥物處理下，Dnmt3aKO細(xì)胞也表現(xiàn)出更強(qiáng)的DDR抵抗，而這種抵抗在催化失活突變體（Δ/E752A, Δ/R832A）中減弱或消失（圖7I）。提示Dnmt3a通過非甲基化依賴性方式整合并調(diào)控HSCs對(duì)基因毒應(yīng)激（特別是端粒損傷）的DDR信號(hào)。

圖7：Dnmt3a喪失抑制功能失調(diào)端粒處的DDR

結(jié)論和啟示
本研究通過一系列功能實(shí)驗(yàn)和分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)（WGBS、RNA-seq）等揭示DNMT3A除了具有經(jīng)典的DNA甲基化功能外，在造血干細(xì)胞中還具有至關(guān)重要的“非經(jīng)典”功能：DNMT3A可以作為端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度的負(fù)調(diào)控因子，并通過抑制DNA損傷反應(yīng)來維護(hù)基因組完整性。DNMT3A功能缺失突變通過解除這些抑制，使HSCs獲得端粒維持和抗DNA損傷的雙重能力，從而驅(qū)動(dòng)其克隆性擴(kuò)增，這可能是其作為血液腫瘤驅(qū)動(dòng)突變的核心機(jī)制。

在本研究中，DNA甲基化分析（WGBS）并非為了尋找致病性的甲基化差異，而是通過比較催化失活突變與完全敲除的甲基化圖譜，排除功能差異并非源于甲基化差異，從而將研究焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向非甲基化機(jī)制。這是DNA甲基化乃至表觀遺傳學(xué)研究思路中的一個(gè)優(yōu)秀案例。

參考文獻(xiàn)：
Xavier Raj I, …et al, Challen GA. Non-canonical functions of DNMT3A in hematopoietic stem cells regulate telomerase activity and genome integrity. Cell Stem Cell. 2025 Jul 10. doi: 10.1016/j.stem.2025.06.010.