多組學(xué)在揭示ac4C RNA修飾調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制中的應(yīng)用

2025年7月18日，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院謝蕓博士、周傳傳副研究員為共同第一作者，中山六院生殖醫(yī)學(xué)中心學(xué)科帶頭人梁曉燕教授為唯一通訊作者，在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊《Science Advances》上發(fā)表題為“Nicotinamide boosts oocyte quantity and quality by promoting N4-acetylation modification in lupus mice”的科研成果。研究系統(tǒng)揭示了N4-乙酰胞苷（ac4C） RNA修飾在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的卵母細(xì)胞發(fā)育障礙中的核心調(diào)控作用。

本研究通過整合臨床數(shù)據(jù)分析、SLE小鼠模型構(gòu)建及微量轉(zhuǎn)錄組-翻譯組測(cè)序、微量細(xì)胞ac4C測(cè)序（acRIP-seq）等多組學(xué)分析，并結(jié)合功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)揭示了SLE導(dǎo)致卵母細(xì)胞數(shù)量減少和質(zhì)量下降的核心分子機(jī)制：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶10（NAT10）介導(dǎo)的ac4C RNA修飾水平下調(diào)，進(jìn)而損害了包括合子停滯蛋白1（Zygote arrest 1，Zar1）在內(nèi)關(guān)鍵母源基因的翻譯效率，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育障礙。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素B3家族成員煙酰胺（Nicotinamide, NIA）能夠通過抑制去乙酰化酶SIRT1，增強(qiáng)NAT10活性和ac4C修飾水平，從而安全有效地改善SLE小鼠的卵母細(xì)胞質(zhì)量、數(shù)量、體外成熟率及妊娠結(jié)局，為SLE患者生育力保護(hù)提供了靶向RNA表觀轉(zhuǎn)錄組的精準(zhǔn)干預(yù)策略。

英文標(biāo)題：Nicotinamide boosts oocyte quantity and quality by promoting N4-acetylation modification in lupus mice
中文標(biāo)題：煙酰胺通過促進(jìn)狼瘡小鼠的ac4C修飾來提高卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量
發(fā)表時(shí)間：2025-7-18
發(fā)表期刊：Science Advances
影響因子：IF12.5/Q1
技術(shù)平臺(tái)：轉(zhuǎn)錄組-翻譯組、微量ac4C（acRIP-seq）
作者單位：中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院
DOI:10.1126/sciadv.adu0955

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見于育齡期女性的自身免疫性疾病，患者常伴有生育能力下降，目前SLE對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和發(fā)育相關(guān)的基因翻譯過程的影響尚不明確。

本研究首先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和翻譯組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)SLE小鼠卵母細(xì)胞中的蛋白翻譯存在顯著紊亂，且與ac4C修飾相關(guān)。在體外抑制ac4C水平會(huì)顯著降低卵母細(xì)胞的翻譯效率。

接下來，研究人員通過微量ac4C RNA免疫沉淀測(cè)序（acRIP-seq），繪制了SLE小鼠卵母細(xì)胞的ac4C修飾圖譜，并發(fā)現(xiàn)ac4C修飾缺失會(huì)嚴(yán)重?fù)p害Zar1的翻譯效率。

此外，研究人員通過SLE小鼠功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙酰胺干預(yù)可以通過增強(qiáng)ac4C修飾水平，顯著且安全地改善SLE小鼠卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。

本研究結(jié)果揭示了N-乙酰轉(zhuǎn)移酶10（NAT10）介導(dǎo)的ac4C修飾在SLE卵母細(xì)胞異常發(fā)育中的關(guān)鍵作用，并提示了煙酰胺在改善SLE患者生育力方面具有應(yīng)用前景。

研究方法

• T&T-seq（轉(zhuǎn)錄組與翻譯組聯(lián)合測(cè)序）：分別收集SLE和野生型（WT）小鼠的GV期和MII期卵母細(xì)胞，同步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組（總RNA）和翻譯組（核糖體結(jié)合RNA）測(cè)序。通過計(jì)算翻譯效率（TE，翻譯組FPKM/轉(zhuǎn)錄組FPKM）來評(píng)估基因的翻譯活性。
• 微量acRIP-seq：使用抗ac4C抗體對(duì)SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行RNA免疫共沉淀，結(jié)合高通量測(cè)序，在全基因組范圍內(nèi)繪制ac4C修飾圖譜，鑒定ac4C修飾靶基因。

5、分子機(jī)制驗(yàn)證：

• 免疫熒光染色：檢測(cè)卵母細(xì)胞中ac4C、m6A、NAT10、ZAR1的蛋白水平及定位。
• qRT-PCR：驗(yàn)證Nat10、Zar1等基因的mRNA表達(dá)水平。
• 體外功能驗(yàn)證：使用NAT10抑制劑Remodelin處理卵母細(xì)胞，觀察其對(duì)ac4C修飾、翻譯效率及卵母細(xì)胞成熟的影響。

6、干預(yù)實(shí)驗(yàn)：

• 煙酰胺（NIA）處理：對(duì)SLE小鼠進(jìn)行煙酰胺灌胃給藥（100 mg/kg/天），評(píng)估其對(duì)卵母細(xì)胞ac4C修飾水平、數(shù)量、質(zhì)量（線粒體膜電位、紡錘體形態(tài)）、體外成熟率及體內(nèi)胚胎發(fā)育結(jié)局的改善作用。
• 安全性評(píng)估：觀察NIA處理對(duì)SLE小鼠子代主要器官的組織學(xué)影響。

圖1：SLE女性卵巢功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降

（2）SLE小鼠的卵母細(xì)胞損傷
為排除臨床混雜因素，研究使用TLR7誘導(dǎo)的SLE小鼠模型，直接評(píng)估疾病對(duì)卵母細(xì)胞的功能影響。結(jié)果顯示，SLE小鼠超排卵后獲得的GV期和MII期卵母細(xì)胞數(shù)量均顯著少于WT小鼠（圖2A、D）。TMRM染色顯示，SLE小鼠GV期和MII期卵母細(xì)胞的線粒體膜電位顯著降低（圖2B-C），提示能量代謝異常。

線粒體功能持續(xù)受損（圖2E-F），紡錘體形態(tài)異常率升高（圖2G-H），染色體排列紊亂。

IVF實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SLE小鼠MII期卵母細(xì)胞受精后，胚胎發(fā)育阻滯主要發(fā)生于4細(xì)胞期之后（圖2I-J），表明母源-合子轉(zhuǎn)換（MZT）障礙。上述結(jié)果成功模擬了SLE患者卵母細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量雙重受損的臨床特征，為機(jī)制研究奠定了可靠的疾病模型基礎(chǔ)。

圖2：SLE小鼠的卵母細(xì)胞損傷

（3）SLE小鼠卵母細(xì)胞基因表達(dá)異常主要發(fā)生在GV期的翻譯過程
研究通過T&T-seq技術(shù)對(duì)SLE和WT小鼠卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和翻譯組進(jìn)行高通量分析。三維主成分分析（3D PCA）顯示，SLE與WT卵母細(xì)胞在GV期的翻譯組差異最顯著（圖3B-E）�；鹕綀D分析表明，差異表達(dá)基因（DEGs）數(shù)量遠(yuǎn)超轉(zhuǎn)錄組，而MII期差異程度減弱（圖3F-I）。

翻譯效率（TE）累積曲線和散點(diǎn)圖顯示，SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞的整體翻譯效率顯著降低（圖4A），多達(dá)6557個(gè)基因的TE下調(diào)（圖4C）。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，TE下調(diào)基因主要富集于代謝、自噬、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成與降解、、線粒體自噬及細(xì)胞衰老等對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的通路。

圖3：SLE與WT小鼠GV期和MII期卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)與翻譯組學(xué)特征差異

圖4：SLE小鼠卵母細(xì)胞的翻譯失調(diào)

圖5：NAT10介導(dǎo)的ac4C修飾對(duì)SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞基因翻譯的影響

圖6：體外remodelin處理小鼠卵母細(xì)胞的表型與組學(xué)圖譜

（6）Zar1是SLE小鼠中ac4C修飾的重要靶基因
為鑒定ac4C直接調(diào)控的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，研究對(duì)SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行了微量細(xì)胞acRIP-seq，繪制了SLE卵母細(xì)胞ac4C修飾圖譜。技術(shù)質(zhì)控顯示，三次生物學(xué)重復(fù)間ac4C信號(hào)峰分布高度一致（圖7A），共捕獲2757個(gè)轉(zhuǎn)錄本（圖7B），ac4C信號(hào)峰富集于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）和終止位點(diǎn)（TES）附近，并鑒定出保守的"CXX"乙�；痬otifs（圖7C）。九象限圖分析顯示，ac4C修飾基因在SLE GV期主要表現(xiàn)為"高轉(zhuǎn)錄-低翻譯"特征（圖7D-E），提示ac4C缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄-翻譯解偶聯(lián)。KEGG富集揭示這些基因參與凋亡、緊密連接、間隙連接、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)、核糖體、FoxO信號(hào)、肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)合成等通路（圖7F-G），直接與卵母細(xì)胞成熟與胚胎發(fā)育相關(guān)。

圖7：SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞的acRIP-seq圖譜。

(A) SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞mRNA ac4C修飾分布熱圖（三個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。
(B) acRIP-seq靶基因重疊分析維恩圖。
(C) 在卵母細(xì)胞acRIP-seq peaks中鑒定到的motifs。
(D-E) GV期和MII期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與翻譯組中acRIP-seq靶基因散點(diǎn)圖（SLE vs WT）。
(F) 對(duì)acRIP-seq鑒定出的ac4C基因進(jìn)行KEGG分析。
(G) acRIP-seq鑒定出的ac4C基因代表性KEGG通路。

研究人員進(jìn)一步通過將acRIP-seq靶基因、SLE下調(diào)TE基因及Remodelin下調(diào)TE基因進(jìn)行交集分析，篩選出325個(gè)候選靶標(biāo)，結(jié)合基因在卵母細(xì)胞中的高表達(dá)及其在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育中的已注釋功能，研究鑒定出調(diào)控mRNA翻譯激活與線粒體-核糖核蛋白域組裝的母源效應(yīng)基因Zar1（圖8A-B）。acRIP-seq顯示Zar1在SLE卵母細(xì)胞中ac4C富集程度顯著降低（圖8C），qRT-PCR與免疫熒光證實(shí)其轉(zhuǎn)錄水平不變但翻譯水平與蛋白表達(dá)顯著下降（圖8D-F），且在Remodelin處理組中結(jié)果類似（圖8G-H）。

上述研究結(jié)果得益于acRIP-seq技術(shù)的成功運(yùn)用，從全基因組范圍內(nèi)篩選并驗(yàn)證Zar1是受ac4C修飾調(diào)控的關(guān)鍵下游靶基因，其翻譯受損直接影響了卵母細(xì)胞的發(fā)育力。

圖8：Zar1是SLE卵母細(xì)胞中ac4C修飾的靶基因之一。

(A) acRIP-seq靶基因、SLE GV期卵母細(xì)胞中翻譯效率（TE）下調(diào)基因以及remodelin處理卵母細(xì)胞中TE下調(diào)基因的重疊情況維恩圖。
(B)人和小鼠ZAR1中潛在的ac4C修飾位點(diǎn)。
(C) WT與SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞acRIP-seq中Zar1的富集倍數(shù)水平。
(D) qRT-PCR結(jié)果顯示SLE與WT GV期卵母細(xì)胞中鼠Zar1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。
(E-F) WT和SLE GV期卵母細(xì)胞中ZAR1（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的免疫熒光圖像及直方圖。
(G-H) remodelin處理組與對(duì)照組GV期卵母細(xì)胞中ZAR1和細(xì)胞核的免疫熒光圖像及直方圖。

（7）煙酰胺通過增強(qiáng)ac4C修飾改善SLE小鼠卵母細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量
基于SIRT1通過去乙酰化抑制NAT10活性的機(jī)制，研究假設(shè)并驗(yàn)證了NIA可增強(qiáng)SLE卵母細(xì)胞的ac4C修飾。體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定100 mg/kg為最低有效劑量，正式實(shí)驗(yàn)顯示NIA處理的SLE小鼠GV期卵母細(xì)胞ac4C修飾水平與ZAR1蛋白表達(dá)顯著回升（圖9B-D）。功能表型全面改善：GV期卵母細(xì)胞數(shù)量增加（圖9E），線粒體膜電位恢復(fù)（圖9F-G）；MII期卵母細(xì)胞數(shù)量提升（圖9H），線粒體功能與紡錘體形態(tài)正常化（圖9I-L），體外成熟率提高（圖9M），并顯示出改善胚胎發(fā)育和活產(chǎn)率的趨勢(shì)。

上述研究結(jié)果不僅證明了通過藥理學(xué)手段提升ac4C修飾水平可以挽救SLE導(dǎo)致的卵母細(xì)胞缺陷，還揭示了NIA兼具改善生殖結(jié)局和緩解疾病癥狀的雙重益處，具有重要的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)價(jià)值。

圖9：煙酰胺通過增加ac4C修飾改善SLE小鼠卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量

結(jié)論和啟示
本研究通過acRIP-seq等分析揭示了SLE疾病狀態(tài)下，個(gè)體抑制NAT10翻譯降低卵母細(xì)胞ac4C修飾水平，導(dǎo)致母源性mRNA翻譯效率全局性下調(diào)，關(guān)鍵基因Zar1表達(dá)下調(diào)引發(fā)卵母細(xì)胞成熟障礙與胚胎發(fā)育阻滯。通過功能挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了煙酰胺通過激活NAT10-ac4C軸可安全有效地恢復(fù)卵母細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量，改善SLE小鼠生育力。本研究強(qiáng)調(diào)了ac4C修飾表觀調(diào)控在卵母細(xì)胞發(fā)育及生殖疾病中的關(guān)鍵作用。

微量細(xì)胞acRIP-seq在極少量細(xì)胞（如卵母細(xì)胞、早期胚胎、干細(xì)胞）中研究RNA修飾的動(dòng)態(tài)變化、精確繪制修飾圖譜并關(guān)聯(lián)其功能影響提供了強(qiáng)大的方法學(xué)工具。未來在生殖醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及稀有細(xì)胞研究中具有廣泛應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：
Xie Y, Zhou C, Guo Q, Guo Y, Guo J, Chen L, Liu X, Zeng Y, Liang Q, Wu T, Liu J, Liang X. Nicotinamide boosts oocyte quantity and quality by promoting N4-acetylation modification in lupus mice. Sci Adv. 2025 Jul 18;11(29):eadu0955. doi: 10.1126/sciadv.adu0955.