類器官、腫瘤球、細胞活性檢測的六大常用方法

一、概述
在生物醫(yī)學(xué)研究的廣闊領(lǐng)域中，細胞活性檢測扮演著至關(guān)重要的角色。它不僅幫助科學(xué)家們評估細胞的生存狀態(tài)，還能深入了解細胞對藥物、環(huán)境變化或病理過程的響應(yīng)。類器官/腫瘤球/細胞活性檢測通常包括測量細胞增殖、細胞毒性和細胞死亡等方面。今天，小愛向大家介紹器官/腫瘤球/細胞活性檢測的六大常用方法：細胞代謝檢測方法、DNA合成檢測方法、細胞ATP檢測方法、熒光染料檢測方法、細胞膜通透性檢測方法、細胞LDH檢測方法。

細胞增殖、活力、毒性檢測方法大全

二、檢測方法
1、細胞代謝檢測方法
基于細胞代謝物進行的檢測方法有CCK8法(abs50003)、MTT法(abs50010)、MTS法(abs50011)、WST-1法(abs44133679)、XTT法(abs42088663)。今天，小愛給大家著重比較一下CCK8法和MTT法。

cck-8法和MTT法都是適合大規(guī)模、快速評價藥物的方法。與MTT相比較，cck-8法優(yōu)勢明顯。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，cck-8檢測OD值與活細胞數(shù)的線性關(guān)系比MTT法明顯。而且，MTT法產(chǎn)生不溶于水的藍紫色結(jié)晶，需要有機溶劑DMSO溶解，操作過程中常會出現(xiàn)溶解不完全或細胞丟失的現(xiàn)象，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。cck-8法只是加染料的一步操作，操作簡單，檢測可實時，免去了去除培養(yǎng)基的操作，是細胞增殖、活力、毒性的主流方法。對環(huán)境保護更為有利，不使用有機溶劑DMSO，所需的耗材也少。

下邊是兩個檢測試劑盒的各方面優(yōu)勢比較：

2、DNA合成檢測方法
基于DNA合成進行的檢測方法有Brdu法(abs811906)、EdU-488法(abs50050)、EdU-555法(abs50051)、EdU-594法(abs50052)、EdU-647法(abs50053)。今天，小愛給大家著重介紹一下EDU法。

EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2'-脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團在天然化合物中很少見，在細胞增殖時能夠替代胸苷（胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine）插入正在復(fù)制的DNA分子中， EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針（如Azide Alexa Fluor 488等）通過一價銅離子催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)(Clickreaction)，從而可以進行高效快速的檢測細胞增殖，特別是可以有效地檢測處于S期的細胞百分數(shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比， EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內(nèi)更容易擴散，不需要嚴(yán)格的樣品變性（酸解、熱解、酶解）處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細胞增殖的真實情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。

3、細胞ATP檢測方法
基于細胞ATP進行的檢測方法有2D-ATP法(abs50065)（細胞適用）；3D-ATP法(abs50057)（類器官、腫瘤球適用）；2D/3D-ATP法(abs50059)（細胞、類器官、腫瘤球均適用）。今天，小愛給大家著重比較一下這3種方法的異同點。

相同點：以上3種方法均是借助ATP依賴的熒光素酶催化的熒光素發(fā)光反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光信號測定細胞內(nèi)ATP含量，從而檢測細胞活力或定量檢測活細胞數(shù)目，檢測線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性好。96孔板中，在100個至100,000個細胞范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，但不同細胞的檢測數(shù)量上限會有不同。此外，操作簡單，試劑盒中提供的檢測試劑為即用型，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測速度快，完成檢測僅需約10min，無需洗滌細胞，也無需更換或去除培養(yǎng)液。

不同點：2D-ATP法(abs50065)適用于2D細胞培養(yǎng)體系；而像類器官/腫瘤球這種介于細胞和組織之間的結(jié)構(gòu)需要裂解能力更強的ATP檢測試劑盒，故3D-ATP法(abs50057)采用的試劑裂解能力更強，適用于類器官、腫瘤球的ATP檢測；而2D/3D-ATP法(abs50059)是一款通用型試劑，兼具細胞、類器官、腫瘤球檢測功能，通用性更強。有關(guān)類器官、腫瘤球ATP檢測攻略可以查看鏈接3D腫瘤球&類器官藥敏活性檢測攻略。

4、熒光染料檢測
基于熒光染料進行的檢測方法有活細胞示蹤法(abs50060)、活/死細胞雙染法(abs50056)（類器官、腫瘤球常用）、CFSE染色法(abs9106)、Calcein AM染色法(abs42014734)。今天，小愛給大家著重介紹一下活細胞示蹤法和活/死細胞雙染法。

（1）活細胞示蹤法
研究細胞運動和定位，需要用到對活細胞無毒的專一性探針。Live Cell Tracking Kit提供了一種通用且保存良好的細胞跟蹤試劑(Cell Tracker Green)，用于監(jiān)測細胞的運動，定位，增殖，遷移，趨化性和侵襲性。Cell Tracker Green是一種活細胞熒光示蹤探針，可以通過被動擴散進入細胞，與細胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合，是一種長效細胞示蹤染料。一旦進入細胞，非熒光性的Cell Tracker Green會被胞內(nèi)酯酶水解，產(chǎn)生綠色熒光(Ex/Em=494/521nm)。這些熒光產(chǎn)物只能積聚在具有完整細胞膜的細胞中，因此死細胞和無完整細胞膜不能被染色。Cell Tracker Green對pH變化不敏感，可以由甲醛或戊二醛固定。Cell Tracker Green探針可以在活細胞中保留好幾代，并可以顯示熒光至少一周。探針可被轉(zhuǎn)移到子細胞，但是不轉(zhuǎn)移到群體中的相鄰細胞。

（2）活/死細胞雙染法
在類器官的培養(yǎng)過程中，如果我們想了解類器官的增殖及凋亡狀態(tài)，可以通過對活細胞和死細胞進行熒光染色，通過熒光顯微鏡拍照觀察。

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光(Ex=490nm，Em=515nm)。因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein-AM細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯(lián)合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(Ex=535nm，Em=617nm)，因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。

活細胞/死細胞雙染試劑盒(abs50056)的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標(biāo)記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系，以24孔板，每孔25uL類器官基質(zhì)膠凝聚物為例，每孔添加500uL染色工作液進行染色。具體實驗步驟可參考鏈接類器官原位活死染色實驗攻略。

5、細胞膜通透性檢測
基于細胞膜通透性進行的檢測方法有臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒(abs50036)、伊紅染液(abs9222)、中性紅染色液（0.33%，活細胞染色用）(abs42154867)。

臺盼藍或伊紅染色法，是利用正常的健康細胞能夠排斥臺盼藍或伊紅，而喪失細胞膜完整性的細胞可以被臺盼藍或伊紅染色。臺盼藍或伊紅染色檢測的是細胞膜的完整性，通常認為細胞膜喪失完整性，即可認為細胞已經(jīng)死亡。臺盼藍或伊紅染色后，通過顯微鏡下直接計數(shù)或顯微鏡下拍照后計數(shù)，就可以對細胞存活率進行比較精確的定量。

中性紅是一種弱堿性染料，同時也是一個pH指示劑，其變色范圍在pH值6.4至8.0之間（由紅變黃）。中性紅染色常用于鑒定動物細胞的死活�；罴毎�被染成紅色，而死細胞則不變色，這種方法與臺盼藍染色法相反。通過測定細胞對中性紅的攝入量，可以評估細胞的增殖或毒性情況。

6、細胞LDH檢測
基于細胞LDH進行的檢測方法是LDH法(abs580007)。LDH檢測的原理基于乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，簡稱LDH）的特性。以下是LDH檢測試劑盒(abs580007)的詳細原理：

（1）LDH的分布與釋放：LDH是一種廣泛存在于各種生物體中的穩(wěn)定的胞漿酶，正常情況下不能通過細胞膜。當(dāng)細胞受到損傷或死亡時，細胞膜的完整性被破壞，LDH被釋放到細胞外的培養(yǎng)基中。

（2）LDH活性的測定：LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，同時在這個過程中，NAD+被還原生成NADH。NADH和四唑鹽類化合物INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)在硫辛酰胺脫氫酶(Diaphorase)的催化下反應(yīng)生成紅色的甲臜(Formazan)。

（3）顏色變化與細胞損傷的關(guān)系：甲臜的量與裂解（死亡）的細胞數(shù)成正比。在490nm波長下，甲臜產(chǎn)生吸收峰，可以通過比色來檢測細胞培養(yǎng)液、細胞裂解液等樣品中LDH的活性。吸光度與LDH活性成線性正相關(guān)，即與裂解（死亡）細胞數(shù)呈正相關(guān)。

（4）實驗操作：實驗中，將不同處理組的細胞培養(yǎng)液離心，將上清液移到96孔板中，加入LDH檢測試劑，反應(yīng)一定時間后可以通過酶標(biāo)儀或分光光度計測定釋放的LDH活性。通過比較不同組細胞釋放的LDH活性可以判斷細胞損傷情況的大小。

（5）應(yīng)用：LDH釋放檢測主要應(yīng)用于評估細胞毒性和細胞死亡情況，在藥物篩選、毒理學(xué)研究、細胞培養(yǎng)中都有廣泛的應(yīng)用。同時，在一些疾病的診斷和治療中，如心肌梗塞、肝炎、癌癥等也有一定的參考價值。

綜上所述，LDH檢測是一種通過測定細胞培養(yǎng)上清中LDH活性來評估細胞損傷程度的方法，其靈敏度、方便性和精確性使其成為細胞毒性分析中的一個重要工具。

今天講解就到這了，大家如有細胞和類器官實驗問題，歡迎一起交流哦！

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