激酶的定義、作用原理及其常見檢測方法
蛋白質磷酸化由 Ed Krebs 和 Ed Fisher 在 1950 年代左右發(fā)現(xiàn)，自此，激酶被認為是細胞信號傳導的重要調節(jié)因子。本期咱們就來嘮嘮有哪些激酶檢測的相關方法~
Section.01
激酶的定義及作用原理
激酶 (Kinase) 是一類能夠促進高能磷酸基團從 ATP 轉移到特定底物，從而產生 ADP 的分子，這一過程又被稱作為磷酸化。
敲重點！��！
基于這個原理，可以通過檢測 ATP 的消耗量，ADP 生成量和磷酸化底物含量，檢測激酶活性。
激酶的三個檢測方向：活性、結合與選擇性
1.抑制活性：化合物在生化水平或細胞水平抑制激酶磷酸化功能的效力。
2.結合能力：檢測化合物與激酶結合的強度、速度 (結合速率) 和持續(xù)時間 (解離速率)。
3.選擇性：檢測化合物對目標激酶及其他數(shù)百種激酶的特異性又被稱為激酶譜篩選，高選擇性是激酶藥物應用時低毒副作用的保障。
Section.02
激酶常見檢測方法
生化水平檢測
通過使用純化的激酶蛋白，直接評估化合物對酶活性的影響。
1.放射性檢測 (經(jīng)典方法)：
該方法是蛋白激酶檢測的一種經(jīng)典方法。使用放射性同位素標記 ATP，蛋白激酶將放射性標記的磷酸基團轉移至肽或蛋白質底物。隨后通過分離并測量底物上摻入的放射性信號來定量激酶活性。優(yōu)點是靈敏度高、可以直接反映激酶活性；缺點是放射性 ATP 的半衰期較短以及存在放射性廢物處理問題[2]。
熒光/發(fā)光法 (FRET, TR-FRET, AlphaScreen/LISA)：
熒光法是現(xiàn)代高通量篩選的主力�；谀芰抗舱褶D移或化學發(fā)光等原理，通過檢測磷酸化底物產生的光學信號反應激酶活性。由于更易操作、高靈敏度和高通量，非常適合大規(guī)模初篩，熒光方法已在很大程度上取代了傳統(tǒng)的放射性標記檢測。缺點是如果化合物本身有很強的自發(fā)熒光或者蛋白水解酶的抑制性，會產生假陽性。
1. 時間分辨熒光 (Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)
由于樣品中的蛋白質、緩沖液組分、塑料器皿等本身會產生微弱的短壽命熒光，傳統(tǒng)熒光檢測 (如 FRET，熒光共振能量轉移) 通常會受到背景熒光的干擾。TR-FRET 使用具有長熒光壽命的鑭系元素 (如銪 Eu3?、鋱 Tb3? 等) 作為供體熒光基團，標記在磷酸化抗體/肽段上，在激發(fā)一段時間后再對熒光數(shù)值進行檢測，可以極大程度消除背景熒光干擾，提高信噪比。當供體和受體 (染料，如 XL665、d2) 在足夠近的距離 (通常 1-10 nM) 內，且供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊時，激發(fā)供體的能量會非輻射地轉移到受體上，導致受體發(fā)出熒光[3]。受體熒光/供體熒光的比值與磷酸化底物的量，即激酶活性成正比。
圖 1. TR-FRET檢測原理[3]。2. Kinase-Glo 方法 (檢測剩余 ATP)：
Kinase-Glo 是一種均質的非放射性的方法，激酶反應結束后，加入等體積的 Kinase-Glo 試劑，試劑中的螢光素酶會利用反應體系中剩余的 ATP 產生化學發(fā)光信號，從而定量地檢測純化激酶的活性，信號強弱與激酶活性成反比[4][5]。Kinase-Glo 法幾乎適用于任何底物為 ATP 的酶的檢測，且操作簡單，無需洗滌，適合大規(guī)模篩選。
圖 2. Kinase-Glo檢測原理[5]。3. ADP-Glo 方法 (檢測生成的 ADP)：
Kinase-Glo 實驗中，通過加入 ADP-Glo 試劑終止激酶反應，并耗盡剩余的所有 ATP。此時體系中沒有 ATP，不會產生背景發(fā)光。接著，加入專門的檢測試劑，將第一步中激酶反應生成的 ADP 重新轉化為 ATP。新生成的 ATP 通過螢光素酶系統(tǒng)產生化學發(fā)光信號，活性信號強弱和激酶活性成正比[5]。
由于通量高，成本較低，操作簡單，Kinase-Glo/ADP-Glo 法幾乎可檢測任何激酶活性，是大規(guī)模高通量篩選初篩的首選方法。而相較于 Kinase-Glo 法，ADP-Glo 消除了高濃度初始 ATP 背景的干擾，可以檢測更微小的活性變化，特別適用于高 ATP 濃度的反應條件。
圖 3. (A) ADP-Glo 檢測原理；(B) 發(fā)光反應信號 (RLU) 與 ATP 耗竭實驗 (Kinase-Glo測定) 中的激酶活性成反比，與 ADP-Glo 測定中的激酶活性成正比[5]。4. AlphaScreen/AlphaLISA
AlphaScreen 與 AlphaLISA 技術的核心在于獨特的“單線態(tài)氧通道能量轉移”體系：供體微珠在 680 nm 激光激發(fā)下產生單線態(tài)氧，這種高能分子可在溶液中擴散約 200 nM；只有當生物相互作用將供體與受體微珠拉近至此“作用距離”內，受體微珠才能接收能量并觸發(fā)內部熒光團發(fā)光。
AlphaLISA 平臺是 AlphaScreen 技術的演變，旨在滿足生物標志物檢測高通量檢測的要求，主要以即用型試劑盒形式提供。AlphaLISA 類似于 AlphaScreen，不同之處在于磁珠含有銪作為受體熒光。銪發(fā)射在光譜上比 AlphaScreen 測定中觀察到的更強烈且更清晰。因此，發(fā)射波長不易受到血紅蛋白或轉鐵蛋白等化合物的基質干擾。與 ELISA 比，AlphaLISA 分析范圍更廣檢測更加靈敏，且可省去很多洗滌步驟，節(jié)省實驗時間[6]。
圖 4. AlphaScreen 檢測原理：供體和受體之間的化學能轉移[6]。細胞水平檢測 (Cellular Assays)
相較于分子水平實驗，細胞水平的檢測更加貼近生物體的病理生理狀態(tài)。將細胞 (通常是疾病相關模型，如癌細胞系) 使用化合物處理后，然后檢測下游信號通路的改變。可以使用磷酸化特異性抗體，通過 Western Blot、細胞免疫熒光、流式等方法檢測目標激酶的自磷酸化或底物磷酸化水平。該方法適合于單個化合物或者化合物數(shù)量不多時候的激酶活性檢測，通量較低。
結合性檢測 (Binding Assays)
結合性檢測不直接測量酶活性，而是更加關注化合物與激酶的“親密接觸”。
1. 表面等離子共振 (Surface Plasmon Resonance,SPR)：
表面等離子體共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一種高靈敏度的生物傳感技術，通過監(jiān)測生物分子在金屬薄膜表面的相互作用，實時、無標記地提供結合動力學和親和力數(shù)據(jù)，廣泛應用于分子互作檢測。
SPR 技術的核心是利用光在不同介質中產生消逝波后與金屬表面的等離子波產生共振，當固定在芯片上的配體和流經(jīng)芯片的分析物發(fā)生結合和解離時，芯片表面質量變化造成共振角發(fā)生變化，傳感圖會實時記錄相互作用下的信號值，根據(jù)此變化曲線從而得出分子間相互作用的解離常數(shù) (KD)、結合速率常數(shù) (Ka) 和解離速率常數(shù) (Kd)。通過 SPR 檢測，可直接獲取激酶與化合物之間的親和力數(shù)據(jù)，對生化實驗篩選出的激酶抑制劑進行驗證。
圖 5. SPR 檢測原理。Section.03
小結
本期，小 M 帶大家了解了激酶活性檢測到底有哪些方法。當然，MCE 也可提供激酶系列化合物庫，及激酶譜篩選技術服務，一站式解決激酶抑制劑活性評價需求。有需要的老師快來私戳小 M 咨詢吧！
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[1] Roskoski R Jr. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2025 update. Pharmacol Res. 2025 Jun;216:107723.
[2] Hastie CJ, et al. Assay of protein kinases using radiolabeled ATP: a protocol. Nat Protoc. 2006;1(2):968-71.
[3] Zhang Y, et al. Progress and Prospects in FRET for the Investigation of Protein-Protein Interactions. Biosensors (Basel). 2025 Sep 19;15(9):624.
[4] Koresawa M, et al. Novel detection method for chemiluminescence derived from the Kinase-Glo luminescent kinase assay platform: Advantages over traditional microplate luminometers. MethodsX. 2014 Aug 8;1:96-101.
[5] Tanega C, et al. Comparison of bioluminescent kinase assays using substrate depletion and product formation. Assay Drug Dev Technol. 2009 Dec;7(6):606-14.
[6] Eglen RM, et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Chem Genomics. 2008 Feb 25;1:2-10.
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