大鼠卵巢卵泡膜細(xì)胞提取攻略及步驟

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、動(dòng)物：6–8周性周期規(guī)律的SD大鼠（體重180–220g）。

2、主要試劑
• DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（abs9560）
• 胎牛血清（abs972）
• ITS （abs9462）
• 雙抗（abs9244）
• 組織解離液（abs9482）
• 0.25%胰蛋白酶-EDTA（abs47014938）
• 10xPBS（abs961）
• 1xPBS（abs962）
• Percoll（abs9102）
• 70um細(xì)胞篩網(wǎng)（abs7232）
• 細(xì)胞培養(yǎng)皿（35mm）（abs7004）
• 細(xì)胞培養(yǎng)皿（60mm）（abs7005）
• 1mL注射針頭
• 抗體：CYP17A1（兔多抗，標(biāo)記TC）和FSHR（兔多抗，排除顆粒細(xì)胞）

二、卵泡膜細(xì)胞提取與分選
1、卵巢取材
頸椎脫臼處死 → 75%乙醇消毒 → 迅速摘取雙側(cè)卵巢 → 置于冰DMEM/F12（+1%雙抗）中。

2、卵泡預(yù)處理
（1）用顯微鑷撕去卵巢被膜及黃體 → 將卵巢置于35mm皿中，加入1mL DMEM/F12。
（2）用1mL注射針頭反復(fù)穿刺卵泡，釋放并棄去顆粒細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體，保留卵泡殘余壁（富含膜細(xì)胞）。

3、酶消化
（1）將卵泡殘余壁剪碎成0.5-1mm3 的小組織塊，將組織塊（100-200mg）轉(zhuǎn)移到2mL圓底管中，加入1mL消化液（abs9482），37℃水平搖床80rpm的速度輕輕搖動(dòng)孵育30-40min（根據(jù)組織糜爛狀態(tài)適當(dāng)延長時(shí)間）
（2）從水平搖床中取出圓底管，劇烈渦旋管10-20s，通過70um細(xì)胞篩網(wǎng)（abs7232）過濾，用10mL PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng);
（3）收集含有細(xì)胞的濾液到50mL管中，20℃下400g離心5min，棄上清。

4、Percoll密度梯度純化
（1）35% Percoll溶液
Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液(10x)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液。
用100% Percoll母液和1xPBS按體積比7:13混合，配制35%等滲Percoll溶液。

（2）50% Percoll溶液
Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液(10x)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液用100% Percoll母液和1xPBS按體積比1:1混合，配制50%等滲Percoll溶液

（3）吸取1mL 50% percoll深入到15mL離心管底部
（4）用2mL，35% percoll （abs9102）重懸細(xì)胞沉淀，沿著管壁緩慢加入含1mL 50% percoll離心管中，覆蓋在50%Percol 溶液的頂部形成密度梯度

▲ 注意：不要破壞35% Percoll和50% Percoll與細(xì)胞的懸液的分界面，35%和50% percoll現(xiàn)配現(xiàn)用

（5）400xg，20℃，離心10 min，升速(ACC)1，降速(DEC)1
（6）離心結(jié)束后，吸取中間35%/50%界面層細(xì)胞（富含TC）至新的15mL離心管中，加入3倍體積4℃預(yù)冷1xPBS，上下顛倒混勻， 4℃下400g離心5min，棄上清
（7）按照步驟 （6） 重復(fù)清洗一次，棄上清得到細(xì)胞

5、差速貼壁進(jìn)一步去雜
（1）將細(xì)胞重懸于 DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 雙抗，接種于 6cm 皿，37℃、5% CO₂ 孵育 2h。
（2）輕輕吸去未貼壁的顆粒細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

6、純度鑒定
（1）取培養(yǎng) 24h 的細(xì)胞做免疫熒光：CYP17A1⁺/FSHR⁻ 判定為 TC，純度通常 > 90%。
（2）亦可做 qPCR 檢測 Lhcgr、Cyp17a1 高表達(dá)，而 Fshr 低表達(dá)。

三、培養(yǎng)與傳代
1、培養(yǎng)基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% ITS + 1% 雙抗。
2、每 2–3 天換液；細(xì)胞長至 80% 匯合時(shí)，0.25% 胰酶-EDTA 消化 1–2 min，1:3 傳代。
3、前 3 代以內(nèi)功能最穩(wěn)定，建議實(shí)驗(yàn)在此窗口內(nèi)完成。

四、注意事項(xiàng)
1、消化時(shí)間勿超 90min，以免降低活率。
2、Percoll離心后收細(xì)胞時(shí)，界面層需精準(zhǔn)吸取，避免混入紅細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。
3、若需無血清實(shí)驗(yàn)，可把 FBS 降至 2% 并添加 ITS（胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒）。

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