試劑追蹤平臺用于驗證提供T細胞免疫斑點法檢測的無錯誤實施審計軌跡

試劑追蹤平臺™用于驗證并提供T細胞免疫斑點法檢測的無錯誤實施審計軌跡
摘要
ELISPOT 和 FluoroSpot檢測方法，統(tǒng)稱為ImmunoSpot檢測法，能夠可靠地檢測新近分離的細胞材料(如外周血單核細胞【PBMC】)中稀有的抗原特異性T細胞。確定這些細胞在所有PBMC 中的頻率有助于評估抗原特異性T細胞免疫力的規(guī)模;同時測量其細胞因子標(biāo)志物則能揭示這些T細胞的譜系及效應(yīng)功能，即T細胞介導(dǎo)免疫的質(zhì)量。由于其無與倫比的靈敏度、實施便利性、可靠性以及對 PBMC利用的節(jié)約性，T細胞ImmunoSpot檢測法正日益成為標(biāo)準(zhǔn)免疫監(jiān)測方法庫中不可或缺的一部分。 對于受監(jiān)管的工作流程而言，對生成的數(shù)據(jù)進行嚴格的審計追蹤是一項必要條件。盡管這在分析T細胞免疫斑點檢測結(jié)果時已完全實現(xiàn)，但對于實際測試中濕實驗室環(huán)節(jié)的執(zhí)行工作而言，此類追蹤尚屬缺失。在此，我們提出一種解決方案，旨在增強并驗證T 細胞免疫斑點檢測的無誤執(zhí)行過程。
ELISPOT和FluoroSpot檢測均能直觀顯示單個細胞的分泌痕跡[1]這兩種測試系統(tǒng)僅在板載分析物的可視化層面有所不同：在前者中，檢測抗體被耦合至一種酶，該酶能夠催化生成一種在白光下可被檢測到的沉淀性底物；而在后者中，板載分析物則通過熒光標(biāo)記的檢測抗體進行可視化。ELISPOT適用于單色和雙色分析[2]而對于需對超過 2 種分析物進行明確測量的情形，則需采用 FluoroSpot 測試方法，該方法使用光譜不重疊的熒光染料[3]除此之外，這兩種檢測方法完全相同，我們統(tǒng)稱為“免疫斑點”
免疫斑點 ® 檢測技術(shù)在 T 細胞免疫監(jiān)測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。這歸因于其檢測系統(tǒng)對檢測 PBMC 和其他新分離細胞材料中抗原特異性 T 細胞（除極少數(shù)情況外，此類細胞通常以極低頻率出現(xiàn)）的空前高靈敏度[4]該檢測方法的成功還得益于其對細胞利用率的節(jié)約性（見注釋 1）。即使在冷凍保存的PBMC樣本被進行檢測時，其性能也不會受到影響[5]最后但同樣重要的是，ImmunoSpot®} 檢測方法的簡潔性和可靠性使其非常適合用于臨床試驗中的監(jiān)管驗證[8]PBMC 的經(jīng)濟實用性，加之 ImmunoSpot®} 的高通量能力，使得我們能夠批量檢測數(shù)十乃至數(shù)百名受試者的 PBMC，以評估其 T 細胞對數(shù)百種個體抗原/肽的反應(yīng)性，而每位捐贈者均可參與此項檢測[9]此類試劑至關(guān)重要，例如在高分辨率 CD8+ T 細胞免疫監(jiān)測中的應(yīng)用。由于 CD8+ T 細胞對表位/肽段的識別在純合子個體間具有高度可變性和不可預(yù)測性（“隨機”）【10、20、21】，只有通過對廣泛肽庫進行測試才能全面評估個體中抗原特異性 CD8+ T 細胞庫的規(guī)模和精細特異性。然而，在進行涉及眾多捐贈者 PBMC 和多種抗原的復(fù)雜測試時，存在重大的人為錯誤風(fēng)險。為克服這一問題，我們引入了中性的“試劑追蹤”染料[11]這有助于進行視覺驗證：（a） 正確的抗原是否已鋪入正確的孔中，（b） 正確的量/體積的抗原是否已鋪就，（c） 細胞是否已添加（d） 并達到正確的數(shù)量/體積。圖 1 中展示了一個典型的 96 孔板，其上標(biāo)記有 Reagent-Tracker®}抗原（參見注釋 2）。在本章中，我們將介紹一款軟件工具——Reagent Tracker（RT）軟件™這有助于通過自動化圖像分析來驗證 ImmunoSpot® 檢測方法實施的準(zhǔn)確性，同時還能提供防篡改的審計追蹤記錄（見注釋 3）。圖 2a 顯示，Reagent Tracker®} 染料在 3D 彩色空間中可通過圖像分析輕松區(qū)分：每種染料的顏色均可被表示為 RGB 坐標(biāo)的緊密集群。這使得 RT 軟件能夠...™為了明確驗證某孔中實際呈現(xiàn)的顏色是否確實與預(yù)想應(yīng)存在于該孔中的顏色（抗原/肽）相符。若出現(xiàn)與這些顏色坐標(biāo)值不符的情況，則表明存在雜質(zhì)，例如由抗原灑落所致。軟件會自動識別并對此進行標(biāo)注。這些定義好的顏色的光學(xué)密度反映了每孔所涂布的體積，從而有助于識別定量抗原移液操作的誤差。RT 軟件™該系統(tǒng)還能自動評估此類偏離計劃產(chǎn)量的情況是否已出現(xiàn)，從而能夠?qū)Ξ惓Ｓ途�進行標(biāo)記。
圖 1 對移液準(zhǔn)確性的顏色編碼驗證。（a） 展示的是標(biāo)準(zhǔn) 96 孔 T 細胞免疫斑點®}板，未顯示試劑追蹤器™染色后，每孔加入 100 μL 的抗原和 PBMC，兩者均置于含有酚紅的中性介質(zhì)中。由于所有孔的外觀都相似，因此無法驗證加樣操作的準(zhǔn)確性。（b）ImmunoSpot®}板：在使用不含酚紅的中性介質(zhì)對彩色編碼抗原進行加樣后使用該板進行檢測。在所示示例中，使用了 8 個 Reagent Tracker™染料被用于對抗原進行顏色編碼；每種抗原均被鋪設(shè)在彼此相鄰的復(fù)孔板中。（c）在加入 100 μL 含酚紅介質(zhì)中的 PBMC 后，B 所示的板面情況

圖 2 試劑追蹤器定義™在 RGB 空間中的染料。（a）圖 1b 中所示的板片被掃描至 ImmunoSpot® Reader} 設(shè)備上，而包含八種 RT 染料的孔則被分別定義在了紅–綠–藍色彩空間中。坐標(biāo)軸以相應(yīng)顏色顯示。（b）圖 1c 中所示的板片被掃描，色彩空間亦被如上定義。請注意，在添加含有酚紅介質(zhì)中的細胞后，每種顏色的 RGB 坐標(biāo)點均發(fā)生了顯著偏移

如圖 1b 與 1c、圖 2a 與 2b 中所示，在含有酚紅介質(zhì)中加入 PBMC 后會導(dǎo)致 RT 染料出現(xiàn)明顯顏色變化。這種變化可通過 RT 軟件進行評估，從而自動驗證細胞是否確實被添加至每個孔中，以及計劃添加的數(shù)量（體積）是否已到位。
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