hPSC誘導(dǎo)分化多巴胺神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)的具體步驟及流程

多巴胺神經(jīng)元能表達(dá)人腦多巴胺神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物（如 TH、DAT、GIRK2 等），適用于體外研究。今天小愛帶大家了解一下hPSC誘導(dǎo)分化多巴胺神經(jīng)元具體流程。以6孔板的2個(gè)孔hPSC分化為例，最終可獲得 6 個(gè)孔的成熟多巴胺神經(jīng)元（至少 1.2×10^7個(gè)細(xì)胞）。

一、誘導(dǎo)材料準(zhǔn)備
1、所需試劑
hPSC誘導(dǎo)分化多巴胺神經(jīng)元試劑盒（abs90320-1kit）

產(chǎn)品組分

注：括號(hào)內(nèi)容如50×為母液濃度，使用時(shí)終濃度需為1×。例如補(bǔ)充劑A（50×）和補(bǔ)充劑（10×）需添加進(jìn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基1使其分別稀釋50倍以及10倍，使得補(bǔ)充劑終濃度為1×，配成mNPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0-2）。包被液1濃度250 U/mL表示每毫升有250個(gè)單位的包被蛋白，在本方案中鋪板時(shí)，每平方厘米需要2個(gè)單位的包被蛋白。

2、需自備試劑與耗材：
試劑：
（1）H9人胚胎干細(xì)胞（無飼養(yǎng)層）（abs9412）；
（2）Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（abs9404）；
（3）Y-27632（abs812864）；
（4）DMEM/F12（abs9560）；
（5）細(xì)胞消化液（干細(xì)胞級(jí)別）（Accutase）（abs47014935）；
（6）ES/iPS細(xì)胞凍存液（abs9412）；
（7）PBS（abs962）；

耗材：
（1）細(xì)胞培養(yǎng)板（標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板）（abs7033）
（2）細(xì)胞培養(yǎng)板（標(biāo)準(zhǔn)透明12孔板）（abs7034）
（3）細(xì)胞培養(yǎng)板（標(biāo)準(zhǔn)透明24孔板）（abs7035）
（4）10mL一次性移液管（abs7053）
（5）25mL一次性移液管（abs7054）
（6）2mL內(nèi)旋凍存管（abs7164）

二、誘導(dǎo)分化流程圖

hPSC：人多能干細(xì)胞；mNPC：中腦神經(jīng)祖細(xì)胞；mDA：中腦多巴胺神經(jīng)元；

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法（以 hESC H1 及 6 孔板 1 個(gè)孔為例）

1、試劑準(zhǔn)備：

（1）在 4℃解凍 補(bǔ)充劑 A、B、C、D、E，不要在 37℃條件下解凍。
（2）在生物安全柜中，參照“產(chǎn)品組成“及“試劑準(zhǔn)備”，按照比例使用無菌移液管及槍頭混勻配制成分化各階段培養(yǎng)基 。例如 mNPC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0-2）組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1、1×濃度的補(bǔ)充劑 A、B，若用量為 10mL，配制方法為 8.8 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1+200μL 補(bǔ)充劑 A（50×）+1 mL 補(bǔ)充劑 B（10×）。
（3）分化培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，置于 4℃儲(chǔ)存，2 周內(nèi)使用。

注：補(bǔ)充劑 B 使用時(shí)盡量避光，且所有補(bǔ)充劑可根據(jù)使用量進(jìn)行分裝以避免反復(fù)凍融。

2、hESC 培養(yǎng)和準(zhǔn)備:（詳見Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（abs9404）使用說明書）
3、DAY0-9: hESC 分化為中腦神經(jīng)祖細(xì)胞（mNPC）
（1）包被液 1 和 2 在 4℃下解凍，與 DMEM/F12 均勻混合，按 2 U/cm2的包被密度鋪板，備用。
（2）DAY0：當(dāng)hESC的匯合度達(dá)到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1×室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)  清洗 hESC，吸去 PBS。
（3）加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，轉(zhuǎn)移到 37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中5min，使其解離成單細(xì)胞。
（4）3-5min 后，將干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞單懸液收集到 15mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。
（5）從包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。
（6）離心結(jié)束，充分去除上清，將 1 mL 預(yù)熱的 mNPC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0-2）（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1×補(bǔ)充劑 A，1×補(bǔ)充劑 B）（含 10μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將細(xì)胞接種到步驟 1 制備的包被板上使得最終密度為 6-8×104個(gè)細(xì)胞/cm2，在 6 孔板中每孔最終體積為 2 mL（含 10μM Y-27632），將孔板轉(zhuǎn)移到 37℃、5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 48 h（若 24 h 后培養(yǎng)基變黃則及時(shí)用含 10μM Y-27632 的 mNPC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基換液(0-2)）。
（8）DAY2：使用 mNPC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（2-7）換液（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1×補(bǔ)充劑 A，1×補(bǔ)充劑 C），直到第 7 天。
（9）DAY7：使用 mNPC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（7-9）換液（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1×補(bǔ)充劑 A，1×補(bǔ)充劑 D），培養(yǎng)至第 9 天�？扇〉� 9 天的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè) NPC 標(biāo)志物如 SOX2、Nestin，中腦標(biāo)志物 FOXA2。 
注：包被液使用時(shí)需在冰上操作，所有與包被液直接接觸的物品需提前預(yù)冷。包被液鋪板后盡量于 1 周內(nèi)使用，使用前需至于室溫 1h 或 37℃培養(yǎng)箱孵育 30 分鐘以上，以恢復(fù)至室溫。

4、DAY9-23: mNPC 誘導(dǎo)分化為中腦多巴胺神經(jīng)元(mDA)
（1）DAY9： 第 9 天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在 6 孔板中每孔用 2 mL 1×室溫 PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除 PBS。
（2）加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，轉(zhuǎn)移到 37℃ 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細(xì)胞。
（3）3-5min 后，將 DMEM/F12（含 10μM Y-27632）以等體積直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞單懸液收集到 15mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。
（4）從包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。
（5）離心結(jié)束，充分去除上清，將適量預(yù)熱的 mDA 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1 ×補(bǔ)充劑 A）（含 10μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。按 1：3 比例接種在包被液 1 包被的板中，每孔加入 2 mL 細(xì)胞懸液于 37℃、5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 。
（6）DAY11: 第 11 天開始根據(jù)培養(yǎng)基顏色每天或隔天更換一次 mDA 誘導(dǎo)培養(yǎng)基，直到第 23 天。

注：D23 天的 mDA 可用無血清細(xì)胞凍存液plus（abs9478）在液氮中冷凍。

5、DAY 23-40: mDA 成熟階段 
（1）DAY23: 第 23 天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6 孔板中每孔用 2mL 1×室溫 PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，吸去 PBS。
（2）每孔加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，將培養(yǎng)物置于 37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 5 min。
（3）5min 后每孔加入 1mL DMEM/F12（含 10μM Y-27632），輕輕吹打細(xì)胞，使其脫離孔底。
（4）將細(xì)胞懸液收集到 15 mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。
（5）仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用 1mL 恢復(fù)室溫的 mDA 成熟培養(yǎng)基（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2，1×補(bǔ)充劑 E）（含 10μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。
（6）使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞接種到提前制備的包被液 2 包被的 6 孔板上使得密度為 6-8×105個(gè)細(xì)胞/cm2 ，根據(jù)培養(yǎng)基顏色每天或隔天換液，直到第 25 天。
（7）DAY25: 更換為不含 Y-27632 的 mDA 成熟培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基顏色每天或隔天換液，直到第 40 天。
（8）第 40 天可檢測(cè)到神經(jīng)元標(biāo)志物（MAP2），多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志物（TH、DAT、GIRK2）的表達(dá)。

注：由于細(xì)胞密度較高，注意及時(shí)換液。

所需產(chǎn)品清單