人多能干細胞(hPSC)誘導心臟類器官培養(yǎng)攻略

人多能干細胞的培養(yǎng)方法

一、實驗準備
1、人多能干細胞培養(yǎng)基配制
（1）2-8℃解凍 hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20 - 80℃，避免反復凍融；
（2）按 1:50 的比例將 hPSC Medium Supplement（10mL）加入到 hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細胞培養(yǎng)基（abs9403）。
注意：混勻后的人多能干細胞培養(yǎng)基可在 2-8℃ 穩(wěn)定儲存 2-3 周，不建議使用配制已超過 3 周的人多能干細胞培養(yǎng)基。
（3） 實驗試劑平衡：人多能干細胞培養(yǎng)基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。
注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要 37℃水浴加熱。

二、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)

hPSC 細胞復蘇：
1、實驗操作步驟：
1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL 即用型基質(zhì)膠（abs9410），輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 1h~2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡 20min。如果暫時不用，可用 Parafilm 封口后 2-8℃ 儲存，并于 1 周內(nèi)使用。

注意：
①一支凍存的干細胞的數(shù)量在 1×10 6cells/mL 左右，對應(yīng) 6 孔板 1 孔；
②即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將 2~3mL 的干細胞培養(yǎng)基加入 15mL 離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入 37℃溫水中，快速搖動，使其在 1~2min 內(nèi)快速解凍；
注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細胞培養(yǎng)基的 15mL 離心管中，將 15mL 離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm 離心 3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加 1mL 人多能干細胞培養(yǎng)基對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸 3~5 次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細胞懸液加入到已經(jīng)包被好的 6 孔 板中，并補全每孔 2mL 培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的 6 孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈 4 個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使細胞均勻分布。并置于 37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 第 2 天觀察細胞貼壁情況；

1.8、換液：從復蘇的時間開始每 24h 換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC 細胞傳代：
2、實驗具體操作步驟：
2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入 1 mL PBS 緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS 緩沖液；

2.2、消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干細胞消化液（abs9409）使之覆蓋皿底，并置于 37℃培養(yǎng)箱中 2~5 min；

注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間 2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入 2mL 人多能干細胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打 3~5 次，使皿底干細胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到 15mL 離心管中；
注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在 3~5 次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正常現(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4、離心：1000rpm 離心 3min，棄上清；

2.5、接種：用干細胞培養(yǎng)基吹打細胞 5-10 次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔 2mL 的培養(yǎng)體系。
注意：吹打細胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過 10 次。

2.6、換液：從傳代的時間開始每 24h 換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC 細胞凍存
3、實驗具體操作步驟：
3.1、清洗：同 2.1；
3.2、消化：同 2.2；
3.3、吹打：同 2.3；
3.4、離心：同 2.4；
3.5、重懸：離心后棄上清，加入 2 mL ES/iPS 細胞凍存液（abs9412）對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸 3~5 次后，將其加入到凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。
注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24 小時后將-80℃冰箱中的細胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

多能干誘導心臟類器官

一、實驗準備
1、hPSC誘導分化心臟類器官試劑盒（abs90364-1kit）

產(chǎn)品組成：

研究階段	名稱	規(guī)格	儲存條件及周期
Ⅰ階段（D0-2）	基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 + 補充劑A	9.98mL + 20μL	-20℃，12個月 / 6個月
Ⅱ階段（D3-4）	基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 + 補充劑B	9.94mL + 60μL	-20℃，12個月 / 6個月
Ⅲ階段（D5-6）	基礎(chǔ)培養(yǎng)基3 + 補充劑C	9.98mL + 20μL	-20℃，6個月
Ⅳ階段（D7-20）	成熟培養(yǎng)基	200mL	-20℃，12個月

2、輔助試劑

序號	品名	貨號	規(guī)格	儲存條件及周期
1	H9人胚胎干細胞（無飼養(yǎng)層）	abs90248	1mL	液氮儲存
2	人多能干細胞培養(yǎng)基Plus	abs9403	500mL	基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃，18個月；添加劑：-20℃，18個月
3	人多能干細胞消化液	abs9409	100mL	-20℃，2年
4	ES/iPS細胞凍存液	abs9412	100mL	-20℃，1年，冰袋運輸
5	即用型基質(zhì)膠	abs9410	100mL	2-8℃保存，有效期6個月。
6	PBS	abs962	500mL	2~8℃或室溫，12個月

  
3、實驗耗材

序號	品名	貨號	規(guī)格	儲存條件及周期
1	細胞培養(yǎng)板(標準透明6孔板)	abs7033	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
2	超低吸附培養(yǎng)板（96孔圓底板）	abs7060	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
3	10mL一次性移液管	abs7053	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
4	25mL一次性移液管	abs7054	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
5	2mL內(nèi)旋凍存管	abs7164	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
6	2mL低溫金屬冰盒(24孔,平底)	abs7289	1個	室溫

二、誘導流程圖

D0-D3：hiPSC形成EB（擬胚體）
D3-D5：EB開始擴大
D5-D7：特化EB誘導
D7：EB分化為心臟類器官
D12：出現(xiàn)早期搏動
D20：心臟類器官成熟

三、實驗方法
1、Ⅰ階段（D0-2）（按1個96孔板，每孔100uL算）
（1）hPSC于基質(zhì)膠包被的六孔板的一個孔生長至70-80%匯合度。
（2）吸去培養(yǎng)基。
（3）孔中加入1mLPBS（無鈣鎂離子）洗，吸去。
（4）孔中加入1mLAccutase，37℃消化3min。
（5）消化完成后于顯微鏡下可看到克隆發(fā)白發(fā)亮。輕拍孔板側(cè)邊幾下，使細胞脫離板底，加入1mL人多能干細胞培養(yǎng)基Plus終止消化，并使用P-1000吸頭將這2mL細胞單懸液收集到15mL 離心管中，室溫下300g離心5min。
（6）離心結(jié)束，去除上清至剩20ul，輕彈管底3-4下，將1mL預熱的人多能干細胞培養(yǎng)基Plus（含10μMY-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
（7）使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞 ，按每孔5000個細胞的比例將所需細胞收集到離心管中，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基1與補充劑A充分混合，將上面1mL細胞懸液加入9mL的含補充劑A的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1中，將細胞吹打均勻，然后按每孔100uL的體積將細胞懸液接種到超低96孔板中，1000rpm離心5min，然后將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中孵育3天。使用低吸附96孔板，可誘導2板192個心臟類器官，成功率70-80%。

2、Ⅱ階段（D3-4）
第3天，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基2與補充劑B充分混勻，配置成Ⅱ階段培養(yǎng)基，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100uL的體積將Ⅱ階段培養(yǎng)基加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天。

3、Ⅲ階段（D5-6）
第5天，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基3與補充劑C充分混勻，配置成Ⅲ階段培養(yǎng)基，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100uL的體積將Ⅲ階段培養(yǎng)基加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天。

4、Ⅳ階段（D7-21）
（1）第7天，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100uL的體積將基礎(chǔ)培養(yǎng)基4加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，開始長期培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)基。
（2）心臟類器官將在分化后的10-13天開始跳動，進一步培養(yǎng)后第19-21天取樣鑒定。

所需產(chǎn)品清單

貨號	品名	規(guī)格	儲存條件及周期
abs90364	hPSC誘導分化心臟類器官試劑盒	1 kit	-20℃，有效期6個月；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃，18個月
abs9495	基質(zhì)膠(低因子,無酚紅)	1.5mL×4	保存-80°C冰箱，有效期 2 年。
abs90248	H9人胚胎干細胞（無飼養(yǎng)層）	1mL	液氮儲存
abs9403	人多能干細胞培養(yǎng)基Plus	500mL	基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃，18個月；添加劑：-20℃，18個月
abs9409	人多能干細胞消化液	100mL	-20℃，2年
abs9412	ES/iPS細胞凍存液	100mL	-20℃，1年，冰袋運輸
abs9410	即用型基質(zhì)膠	100mL	2-8℃保存，有效期6個月。
abs962	PBS	500mL	2~8℃或室溫，12個月
abs7033	細胞培養(yǎng)板(標準透明6孔板)	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7060	超低吸附培養(yǎng)板（96孔圓底板）	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7053	10mL一次性移液管	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7054	25mL一次性移液管	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7164	2mL內(nèi)旋凍存管	1箱	室溫，保質(zhì)期3年
abs7289	2mL低溫金屬冰盒(24孔,平底)	1個	室溫