DAP-seq助力揭示SlWRKY14調(diào)控番茄果色和品質(zhì)的新機(jī)制
2025年10月1日，浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院汪俏梅教授課題組在Cell Reports（IF: 6.9）上在線發(fā)表了題為SlWRKY14 integrates carotenoid and flavonoid biosynthetic pathways to regulate coloration and quality of tomato fruits的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示番茄中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子SlWRKY14通過“轉(zhuǎn)錄激活+表觀抑制”雙重機(jī)制整合類胡蘿卜素與類黃酮兩大代謝途徑，為番茄果實(shí)品質(zhì)改良提供了新靶點(diǎn)與理論依據(jù)。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。
文章主要內(nèi)容
研究背景
在園藝作物研究領(lǐng)域，番茄因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值與科研模型地位，始終是學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。果實(shí)的色澤與營養(yǎng)品質(zhì)，更是育種工作的核心目標(biāo)。果實(shí)著色與營養(yǎng)品質(zhì)的形成主要依賴于類胡蘿卜素（如番茄紅素和β-胡蘿卜素）和類黃酮（如柚皮素查爾酮）等次生代謝產(chǎn)物的積累。但現(xiàn)代育種因長期追求產(chǎn)量和耐儲(chǔ)運(yùn)性，導(dǎo)致果實(shí)中類胡蘿卜素、類黃酮含量顯著下降�，F(xiàn)有研究已明確兩類物質(zhì)的合成通路，但二者協(xié)同調(diào)控機(jī)制未知。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：SlWRKY14直接調(diào)控番茄果實(shí)色澤與代謝物積累
在園藝作物研究領(lǐng)域，番茄因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值與科研模型地位，始終是學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。果實(shí)的色澤與營養(yǎng)品質(zhì)，更是育種工作的核心目標(biāo)。果實(shí)著色與營養(yǎng)品質(zhì)的形成主要依賴于類胡蘿卜素（如番茄紅素和β-胡蘿卜素）和類黃酮（如柚皮素查爾酮）等次生代謝產(chǎn)物的積累。但現(xiàn)代育種因長期追求產(chǎn)量和耐儲(chǔ)運(yùn)性，導(dǎo)致果實(shí)中類胡蘿卜素、類黃酮含量顯著下降�，F(xiàn)有研究已明確兩類物質(zhì)的合成通路，但二者協(xié)同調(diào)控機(jī)制未知。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：SlWRKY14直接調(diào)控番茄果實(shí)色澤與代謝物積累
- 定位候選基因SlWRKY14
此前，為解析番茄類胡蘿卜素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，作者以SlPSY1（類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶）啟動(dòng)子為誘餌進(jìn)行了酵母單雜交（Y1H）篩選。該篩選鑒定出了SlWRKY14（基因編號(hào)Solyc12g006170），這是一種I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。并檢測(cè)了SlWRKY14在三個(gè)代表性番茄品種中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlWRKY14均在果實(shí)破色期（B期）表達(dá)量相對(duì)較高，并在果實(shí)成熟過程中持續(xù)維持高表達(dá)水平。
- SlWRKY14功能驗(yàn)證
作者通過構(gòu)建SlWRKY14 敲除株系（KO）和過表達(dá)（OE）株系，測(cè)定不同成熟階段果實(shí)的表型、色素含量及產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示SlWRKY14 敲除株系果實(shí)呈更深紅色，類胡蘿卜素含量顯著升高、柚皮素查爾酮含量降低；過表達(dá)株系果實(shí)呈橙黃色，類胡蘿卜素含量降低、柚皮素查爾酮含量升高；KO與OE株系的果實(shí)成熟啟動(dòng)時(shí)間（花期到轉(zhuǎn)色期天數(shù)）、乙烯釋放峰值、單果重及單株總產(chǎn)量，與WT無顯著差異；上述結(jié)果表明，SlWRKY14調(diào)控果實(shí)著色且不影響果實(shí)成熟進(jìn)程。
圖1 SlWRKY14調(diào)控番茄果實(shí)著色，且該過程不依賴于果實(shí)成熟進(jìn)程
核心發(fā)現(xiàn)二：SlWRKY14通過“SlWRKY14-SlHDA1模塊”表觀抑制類胡蘿卜素合成
1.SlWRKY14下游調(diào)控分子機(jī)制探究
為研究SlWRKY14轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，作者通過DAP-seq鑒定出SlWRKY14在基因組中的7536富集峰，對(duì)應(yīng)3329個(gè)靶基因，其中有609個(gè)為啟動(dòng)子相關(guān)基因，并鑒定到典型的W-box motif。進(jìn)一步GO和KEGG分析顯示這些基因顯著富集于色素代謝相關(guān)通路，其中包含類胡蘿卜素和類黃酮生物合成的關(guān)鍵步驟。聯(lián)合RNA-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素合成基因（SlDXS1、SlPSY1等）顯著下調(diào)，類黃酮合成基因（SlPALA、Sl4CL等）顯著上調(diào)。 SlWRKY14可能通過調(diào)控MEP途徑與苯丙烷途徑之間的代謝流，實(shí)現(xiàn)對(duì)果實(shí)色素代謝的精準(zhǔn)調(diào)控。進(jìn)一步ChIP-qPCR（體內(nèi)）、EMSA（體外）、酵母單雜交（Y1H）、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SlWRKY14直接結(jié)合SlDXS1、SlPSY1啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)。
1.SlWRKY14下游調(diào)控分子機(jī)制探究
為研究SlWRKY14轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，作者通過DAP-seq鑒定出SlWRKY14在基因組中的7536富集峰，對(duì)應(yīng)3329個(gè)靶基因，其中有609個(gè)為啟動(dòng)子相關(guān)基因，并鑒定到典型的W-box motif。進(jìn)一步GO和KEGG分析顯示這些基因顯著富集于色素代謝相關(guān)通路，其中包含類胡蘿卜素和類黃酮生物合成的關(guān)鍵步驟。聯(lián)合RNA-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素合成基因（SlDXS1、SlPSY1等）顯著下調(diào)，類黃酮合成基因（SlPALA、Sl4CL等）顯著上調(diào)。 SlWRKY14可能通過調(diào)控MEP途徑與苯丙烷途徑之間的代謝流，實(shí)現(xiàn)對(duì)果實(shí)色素代謝的精準(zhǔn)調(diào)控。進(jìn)一步ChIP-qPCR（體內(nèi)）、EMSA（體外）、酵母單雜交（Y1H）、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SlWRKY14直接結(jié)合SlDXS1、SlPSY1啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)。
圖2 SlWRKY14調(diào)控類胡蘿卜素與類黃酮之間的代謝流
圖3 通過DAP-seq和RNA-seq在全基因組鑒定SlWRKY14的結(jié)合位點(diǎn)
圖4 SlWRKY14直接結(jié)合SlDXS1的啟動(dòng)子區(qū)域以抑制其表達(dá)
圖5 SlWRKY14直接結(jié)合SlPSY1的啟動(dòng)子區(qū)域以抑制其表達(dá)
圖3 通過DAP-seq和RNA-seq在全基因組鑒定SlWRKY14的結(jié)合位點(diǎn)
圖4 SlWRKY14直接結(jié)合SlDXS1的啟動(dòng)子區(qū)域以抑制其表達(dá)
圖5 SlWRKY14直接結(jié)合SlPSY1的啟動(dòng)子區(qū)域以抑制其表達(dá)
2.探究SlWRKY14對(duì)類胡蘿卜素生物合成碳流的轉(zhuǎn)錄抑制機(jī)制
為探究SlWRKY14介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制，作者以SlWRKY14為誘餌，對(duì)通過靶向Y2H實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了SlWRKY14與所有已知SlHDA（組蛋白去乙�；福┘易宓鞍椎南嗷プ饔�，結(jié)果顯示，僅SlHDA1能與SlWRKY14發(fā)生特異性相互作用，并通過Y2H、Pull-down、Co-IP、LCI證實(shí)該結(jié)論。隨后通過構(gòu)建SlHDA1-RNAi株系發(fā)現(xiàn)SlHDA1作為SlWRKY14的共抑制因子，參與調(diào)控類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)。通過檢測(cè)SlWRKY14敲除株系與SlWRKY14 過表達(dá)株系果實(shí)的整體組蛋白乙�；�、組蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性、組蛋白去乙�；敢种苿┨幚怼hIP等一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SlWRKY14通過招募組蛋白去乙�；窼lHDA1，去除組蛋白在H3K9和H3K27位置上的乙�；�，以降低組蛋白乙�；讲⒃黾尤旧|(zhì)的緊縮狀態(tài)，從而抑制SlDXS1和SlPSY1的表達(dá)和類胡蘿卜素的積累，且該表觀抑制不影響SlPALA的激活過程。
為探究SlWRKY14介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制，作者以SlWRKY14為誘餌，對(duì)通過靶向Y2H實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了SlWRKY14與所有已知SlHDA（組蛋白去乙�；福┘易宓鞍椎南嗷プ饔�，結(jié)果顯示，僅SlHDA1能與SlWRKY14發(fā)生特異性相互作用，并通過Y2H、Pull-down、Co-IP、LCI證實(shí)該結(jié)論。隨后通過構(gòu)建SlHDA1-RNAi株系發(fā)現(xiàn)SlHDA1作為SlWRKY14的共抑制因子，參與調(diào)控類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)。通過檢測(cè)SlWRKY14敲除株系與SlWRKY14 過表達(dá)株系果實(shí)的整體組蛋白乙�；�、組蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性、組蛋白去乙�；敢种苿┨幚怼hIP等一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SlWRKY14通過招募組蛋白去乙�；窼lHDA1，去除組蛋白在H3K9和H3K27位置上的乙�；�，以降低組蛋白乙�；讲⒃黾尤旧|(zhì)的緊縮狀態(tài)，從而抑制SlDXS1和SlPSY1的表達(dá)和類胡蘿卜素的積累，且該表觀抑制不影響SlPALA的激活過程。
圖6 SlWRKY14與SlHDA1存在物理相互作用
圖7 組蛋白去乙�；傅墓δ苄曰钚允荢lWRKY14-SlHDA1復(fù)合物抑制類胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)錄所必需
核心發(fā)現(xiàn)三：SlWRKY14激活類黃銅生物合成通路
類黃酮是番茄果實(shí)果皮中的主要色素，由SlPAL、SlCHS、SlCHI、SlF3H等酶催化合成，DAP-seq結(jié)果顯示，類黃酮合成途徑中的SlPALA是SlWRKY14直接調(diào)控的靶基因，并通過ChIP-qpcr、EMSA、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)SlWRKY14結(jié)合類黃酮合成關(guān)鍵基因SlPALA啟動(dòng)子W-box并激活其轉(zhuǎn)錄。與抑制類胡蘿卜素合成不同，SlWRKY14激活SlPALA無需SlHDA1參與，且未檢測(cè)到與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）互作，推測(cè)通過未知共激活因子調(diào)控。OE株系中SlPALA表達(dá)量提升3倍，下游類黃酮合成基因（Sl4CL、SlC4H、SlCHS）同步上調(diào)，最終推動(dòng)類黃酮積累。
類黃酮是番茄果實(shí)果皮中的主要色素，由SlPAL、SlCHS、SlCHI、SlF3H等酶催化合成，DAP-seq結(jié)果顯示，類黃酮合成途徑中的SlPALA是SlWRKY14直接調(diào)控的靶基因，并通過ChIP-qpcr、EMSA、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)SlWRKY14結(jié)合類黃酮合成關(guān)鍵基因SlPALA啟動(dòng)子W-box并激活其轉(zhuǎn)錄。與抑制類胡蘿卜素合成不同，SlWRKY14激活SlPALA無需SlHDA1參與，且未檢測(cè)到與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）互作，推測(cè)通過未知共激活因子調(diào)控。OE株系中SlPALA表達(dá)量提升3倍，下游類黃酮合成基因（Sl4CL、SlC4H、SlCHS）同步上調(diào)，最終推動(dòng)類黃酮積累。
圖8 SlWRKY14既是類黃酮生物合成的激活因子，也是類胡蘿卜素生物合成的抑制因子
小結(jié)
綜上所述，該研究揭示了SlWRKY14在番茄果色和品質(zhì)形成中的關(guān)鍵作用。一方面通過直接激活類黃酮途徑基因SlPALA，增強(qiáng)類黃酮的積累，另一方面形成SlWRKY14-SlHDA1調(diào)控模塊表觀抑制類胡蘿卜素途徑基因SlDXS1、SlPSY1，從而抑制類胡蘿卜素的合成，實(shí)現(xiàn)番茄果色的兩條代謝通路差異化調(diào)控。為番茄果實(shí)顏色及營養(yǎng)品質(zhì)改良提供了新靶點(diǎn)，具有重要育種應(yīng)用前景。
綜上所述，該研究揭示了SlWRKY14在番茄果色和品質(zhì)形成中的關(guān)鍵作用。一方面通過直接激活類黃酮途徑基因SlPALA，增強(qiáng)類黃酮的積累，另一方面形成SlWRKY14-SlHDA1調(diào)控模塊表觀抑制類胡蘿卜素途徑基因SlDXS1、SlPSY1，從而抑制類胡蘿卜素的合成，實(shí)現(xiàn)番茄果色的兩條代謝通路差異化調(diào)控。為番茄果實(shí)顏色及營養(yǎng)品質(zhì)改良提供了新靶點(diǎn)，具有重要育種應(yīng)用前景。
圖9 SlWRKY14調(diào)控番茄果色和品質(zhì)形成的分子機(jī)制
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2025.116369
標(biāo)簽：
DAP-seq
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