酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) (ELISPOT) 技術(shù)的原理、發(fā)展與應(yīng)用

傳統(tǒng)方法（如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，ELISA）僅能檢測(cè)細(xì)胞群體分泌蛋白的總濃度，無(wú)法揭示分泌該蛋白的細(xì)胞頻率及其活化狀態(tài)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)蛋白質(zhì)分泌行為進(jìn)行可視化、定量分析，直接反映分泌特定蛋白的功能性細(xì)胞頻率，為評(píng)估細(xì)胞免疫應(yīng)答提供了獨(dú)特視角。

技術(shù)發(fā)展初期，由于B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白量較大，易于檢測(cè)，應(yīng)用較為順利。然而，在T細(xì)胞研究領(lǐng)域，由于其所分泌的細(xì)胞因子量少、檢測(cè)抗體靈敏度不足及顯色膜材質(zhì)限制等因素，該技術(shù)一度面臨斑點(diǎn)不清、靈敏度低及重復(fù)性差等挑戰(zhàn)。直至1996年，Lehmann團(tuán)隊(duì)引入聚偏二氟乙烯膜作為固相載體，其卓越的蛋白吸附能力與顯色分辨率顯著提升了檢測(cè)靈敏度，推動(dòng)了ELISPOT技術(shù)在T細(xì)胞免疫研究中的廣泛應(yīng)用。

1. 包被抗體： 將具有高親和力的捕獲抗體預(yù)先固定于多孔板底部，形成免疫吸附層。

2. 細(xì)胞孵育與刺激： 將待測(cè)細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）接種至板中，并在特定刺激物（如抗原、多肽或促有絲分裂原）存在下進(jìn)行培養(yǎng)，激活目標(biāo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或其他蛋白。

3. 靶蛋白捕獲： 細(xì)胞分泌的靶蛋白在擴(kuò)散至培養(yǎng)基之前，被其周?chē)�的捕獲抗體立即捕獲，在細(xì)胞原位形成免疫復(fù)合物。

4. 檢測(cè)與顯色： 移除細(xì)胞后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，繼而加入酶標(biāo)記的鏈霉親和素。最后加入底物，酶催化底物在抗體捕獲位點(diǎn)產(chǎn)生不溶性的有色沉淀，形成斑點(diǎn)。

5. 結(jié)果分析： 使用自動(dòng)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)或顯微鏡對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)曾分泌靶蛋白的活性細(xì)胞。

表1. T細(xì)胞免疫評(píng)估常用檢測(cè)平臺(tái)比較

與其他技術(shù)相比，ELISPOT的核心優(yōu)勢(shì)在于其極高的靈敏度（可達(dá)百萬(wàn)分之一）以及能夠檢測(cè)細(xì)胞實(shí)際分泌的功能性行為，而非細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存。與ICS相比，ELISPOT無(wú)需使用分泌抑制劑，能夠持續(xù)捕獲整個(gè)孵育期內(nèi)細(xì)胞分泌的蛋白，更適于高通量篩選。

目前，ELISPOT技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，包括但不限于：

• 疫苗免疫學(xué)評(píng)價(jià)（如腫瘤疫苗、病毒疫苗）
• 感染性疾病的免疫應(yīng)答監(jiān)測(cè)（如結(jié)核、HIV）
• 自身免疫性疾病的致病機(jī)理研究
• 移植免疫中的排斥反應(yīng)評(píng)估
• 腫瘤免疫治療的療效預(yù)測(cè)與監(jiān)測(cè)
• ​過(guò)敏原的特異性反應(yīng)研究

綜上所述，ELISPOT作為一種高度靈敏、功能性的單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，為深入理解機(jī)體免疫狀態(tài)提供了不可替代的研究工具，具有廣闊的臨床應(yīng)用與科研前景。

六、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Elispot)相關(guān)技術(shù)服務(wù)哪里有？

樂(lè)備實(shí)（LabEx）提供酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Elispot)相關(guān)技術(shù)服務(wù)

樂(lè)備實(shí)是國(guó)內(nèi)專(zhuān)注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專(zhuān)家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。