免疫細胞化學(xué)免疫熒光 (ICCIF) 實驗操作流程全解析

：請問 ICC 和 IF 有何區(qū)別？是同一個實驗嗎？
：哎嘿，這題我會!

：免疫細胞化學(xué) (Immunocytochemistry, ICC) 在細胞樣本上對靶抗原進行檢測和定位。免疫熒光 (Immunofluorescence, IF) 則是主要使用熒光標(biāo)記物對抗體進行標(biāo)記，從而實現(xiàn)對抗原的可視化檢測。熒光標(biāo)記既可以用于免疫細胞化學(xué)法 (細胞) 也可以用于免疫組織化學(xué)法 (組織)。

：哇哦~曉得了，有沒有操作流程嘞？
：流程？在下面嘍~

Section.01
第一步: 樣品準(zhǔn)備

細胞免疫熒光技術(shù)是一種基于抗體與標(biāo)記物相互作用的技術(shù)。它通過特異性的抗體與細胞表面或細胞內(nèi)分子結(jié)合，再通過標(biāo)記物在熒光顯微鏡下進行觀察。實驗流程通常包括樣品制備、固定、通透、封閉、抗體孵育、復(fù)染、封片和觀察 8 個部分。

 
步驟

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定細胞 10 ~ 15 min；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留的固定液。

Tips:

1. 初次實驗，建議從 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 開始嘗試，倘若沒有達到預(yù)期效果，再調(diào)整固定時間或更換另一種固定劑。
2. 較長的孵育時間通常會導(dǎo)致更高的固定程度，直至表位可能過度固定。孵育時間短可能導(dǎo)致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時間需要根據(jù)經(jīng)驗確定。

Section.03
第三步: 通透

目的

通過去污劑部分溶解細胞膜，形成孔洞，從而使抗體能夠到達細胞內(nèi)表位，與細胞內(nèi)的抗原結(jié)合。(該步驟可選做；通透步驟會破壞細胞膜，細胞膜表面抗原不適合選擇通透實驗)

 
步驟

1. 通透：加入 0.1–0.25 % Triton X-100 (PBS 配制)，覆蓋細胞，室溫下通透 5-10 min ；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留通透液。

Tips:

通透劑的濃度和孵育時間應(yīng)針對所用樣品進行優(yōu)化。

Section.04
第四步: 封閉

目的

封閉液中的成分能夠與細胞表面的非特異性位點結(jié)合，從而阻止抗體與這些位點的非特異性結(jié)合。

封閉液的選擇

可以選擇與二抗相同來源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗為山羊抗小鼠，應(yīng)選擇山羊血清作為封閉劑。

步驟

使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室溫或 37 ℃ 封閉 1 h。

Tips:

1. 封閉溶液不應(yīng)含有一抗的宿主動物血清，因為這可能會導(dǎo)致高背景。
2. 注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

Section.05
第五步: 抗體孵育

目的

使抗體充分與目的蛋白抗原結(jié)合，決定了熒光信號的位置和特異性，進而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

注意：該步驟可選擇 (i) 直接檢測，一抗直接與熒光基團偶聯(lián)。(ii) 間接檢測，使用合適的熒光標(biāo)記二抗檢測一抗。這兩種方法各有優(yōu)點和缺點，其中，間接檢測是最常用的檢測方法。

抗體的選擇

1. 單染：一抗要選擇任一宿主來源的抗體，二抗選擇對應(yīng)的抗一抗宿主的抗體。例如，一抗是小鼠來源，二抗要選擇抗小鼠的抗體 (如山羊抗小鼠，驢抗小鼠等)。
2. 雙染/多染：在進行多個熒光標(biāo)記實驗時，一抗要選擇不同宿主來源的抗體，二抗選擇對應(yīng)的抗一抗宿主的抗體。同時要注意選擇具有高區(qū)分度的熒光二抗，避免熒光重疊。例如，在進行三色熒光標(biāo)記時，一般選用綠色、藍色和紅色這三種熒光基團，以確保每個信號都能被清晰地區(qū)分出來。

步驟
(以間接檢測為例)：

1. 一抗孵育：根據(jù)研目標(biāo)抗原和樣品特性選擇符合要求的一抗，并按照說明書要求稀釋一抗，加入到樣品中并在 4 ℃ 條件下孵育過夜 (12~16 h)。
2. 洗滌：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌次數(shù)和時間可根據(jù)實驗條件調(diào)整。
3. 二抗孵育：根據(jù)一抗的種類及樣品特性 (二抗攜帶的熒光需要與樣品自帶熒光不沖突) 選擇合適的熒光標(biāo)記的二抗，在室溫下避光孵育 1 h。稀釋和使用方法應(yīng)遵循說明書。
4. 洗滌：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌次數(shù)和時間可根據(jù)實驗條件調(diào)整。

Tips:

1. 孵育熒光二抗之后，一定要注意避光保存！
2. 確定合適的二抗工作濃度濃度，避免無信號或背景過高現(xiàn)象的發(fā)生；
3. 注意濕盒的保濕效果，避免樣品的干燥；
4. 洗滌時轉(zhuǎn)速要溫和，防止細胞脫片。

Section.06
第六步: 復(fù)染

目的

使用染色劑對細胞核進行染色，直觀地區(qū)分細胞核和其他細胞及抗原結(jié)構(gòu)的位置，便于觀察和解讀實驗結(jié)果。

步驟

在清洗完畢的細胞中滴加 DAPI，室溫避光靜置約 30 s。

Section.07
第七步：封片

目的

保護已經(jīng)染色的樣本，防止其受到外界環(huán)境的損害。同時，封片還有助于保存實驗結(jié)果，便于后續(xù)的分析和比較。

步驟

1. 封片：向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。
2. 觀察：輕輕用指甲油密封蓋玻片四周，避免樣品在顯微鏡下移動。指甲油干透后，直接觀察或 4 ℃ 下避光保存。

Tips:

1. 避免氣泡：在封片過程中，需要避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會干擾顯微鏡下的觀察，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在滴加封片液時，需要緩慢而均勻地滴加，并用鑷子輕輕調(diào)整蓋玻片的位置，以確保沒有氣泡產(chǎn)生。
2. 選擇合適的封片劑：封片劑的選擇也很重要。常用的封片劑包括緩沖甘油、抗熒光淬滅封片液等。在選擇封片劑時，需要根據(jù)實驗的具體需求和標(biāo)本的特性進行選擇。
3. 保持避光和濕度：封片后，需要將標(biāo)本放置在避光和濕度適宜的環(huán)境中保存。這可以有效地防止熒光信號的淬滅和標(biāo)本的干燥，確保實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
4. 細胞樣品在封片劑處理后，理論上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，為了成像清晰和高熒光強度，建議盡快進行成像分析。

Section.08
第八步: 觀察

成像及分析：在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，并對熒光定位及結(jié)果進行實驗分析。

怎么樣？有沒有躍躍欲試的小念頭？讓我們再來看看科研人的期刊文獻中的免疫熒光 (IF) 成果圖吧！

圖 4. 亞細胞結(jié)構(gòu)免疫熒光圖^[1]。

好啦，朋友們，到這里細胞免疫熒光實驗就結(jié)束啦！你學(xué)會了嗎？從準(zhǔn)備樣本開始，一步步進行固定和抗體孵育，再到最后在顯微鏡下看到那些閃閃發(fā)光的細胞，真的超有成就感！

[1] Thul PJ, et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 2017 May 26;356(6340):eaal3321.