可視化細胞代謝新方案：比例熒光生物傳感器的自動成像與分析
引言
在探索活細胞代謝的科研工作中，使用基因編碼的熒光生物傳感器幫助科學(xué)家觀察細胞內(nèi)的關(guān)鍵代謝物的實時變化，不斷革新著我們對細胞內(nèi)部動態(tài)的理解，為疾病機制解析開辟了新路徑；此外，熒光生物傳感器還展現(xiàn)出了高通量、高內(nèi)涵藥物篩選的巨大應(yīng)用潛力，在藥物研發(fā)過程中，幫助研究者更快地找關(guān)鍵靶點，加速新藥的研發(fā)進程，為患者帶來福音。今天和大家分享一套解決方案，該方案通過 Agilent BioTek Cytation 成像平臺以高通量方式利用基因編碼的生物傳感器進行活細胞研究。
NAD+/NADH 熒光生物傳感器
NAD+/NADH 在多個細胞區(qū)室中扮演眾多角色，其中最重要的功能與線粒體能量產(chǎn)生相關(guān)，它們通過相互轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的有氧和無氧代謝過程。NAD+ 接受電子和氫離子形成還原型 NADH，這一過程是 ATP 生成的關(guān)鍵步驟。目前已經(jīng)開發(fā)出多種能夠在活細胞水平檢 NAD+/NADH 的熒光生物傳感器，比如 SoNar、Peredox 和 iNap 等工具，本案例中采用的 Peredox 傳感器將綠色熒光蛋白的亮度與 NADH 的相對豐度耦合在一起，因此隨著 NAD+/NADH 增加，Peredox 的綠色強度也會增加；此外，Peredox 設(shè)計還包括第二個穩(wěn)定的 mCherry 熒光蛋白作為參考信號，這樣綠光與紅光發(fā)射強度的比值使得 Peredox 報告信號獨立于傳感器表達水平。與強度設(shè)計相比，比率生物傳感器在定量分析方面具有優(yōu)勢，因此，本案例中涉及的自動化策略同樣適應(yīng)其他比例生物傳感器的使用，例如 FRET 傳感器，SoNar 傳感器等。
基于圖像的生物傳感器的高通量檢測流程
由于 NAD+/NADH 比率型熒光生物傳感器的設(shè)計特點通常包括兩種熒光蛋白，能夠提供穩(wěn)定而明亮的細胞內(nèi)熒光信號，非常適合于基于圖像的高通量檢測，一般來說，需要檢測設(shè)備具有多通道、多孔位的自動化圖像采集及圖像分析能力，安捷倫的 Cytation&Gen5 自動化圖像處理平臺能夠為此類比率熒光生物傳感器提供優(yōu)異的檢測性能，主要工作流程如圖 1 所示：包括生物傳感器細胞內(nèi)表達、細胞接種及藥物處理條件優(yōu)化、Cytation 自動化成像平臺圖像采集、Gen5 軟件熒光信號單細胞分析、藥物劑量響應(yīng)曲線擬合和結(jié)果輸出等環(huán)節(jié)。
細胞內(nèi) NAD+/NADH 的可視化檢測
Peredox-mCherry-NLS 生物傳感器在活體 MCF10A 細胞中可視化狀態(tài)如圖 2 所示。當 Peredox 傳感器與 NAD+ 結(jié)合時，綠色熒光信號較暗，而當 Peredox 與 NADH 結(jié)合時，綠色熒光信號較亮。因此，熒光色通道中 Peredox 的強度表示 NAD+/NADH 比率，同時用 mCherry 的紅色熒光信號做傳感器總量的標準化處理。
通過在培養(yǎng)基中添加特定比例的超生理濃度（10 mM）乳酸和丙酮酸，能夠調(diào)控細胞內(nèi) NAD+/NADH 的比例，此方法已經(jīng)被驗證能夠有效將綠紅熒光比的變化轉(zhuǎn)換為胞質(zhì) NAD+/NADH 的比率。圖 2 的上一行圖像中，細胞處于 NAD+/NADH 低的培養(yǎng)基條件，而圖像的下一行展示了細胞內(nèi)高 NAD+/NADH 的培養(yǎng)基條件。
在生理條件下，胞質(zhì)糖酵解速率是影響 NAD+/NADH 比率的主要因素。葡萄糖通過糖酵解生成丙酮酸、ATP 和 NADH。在 MCF10A 細胞中，Peredox 傳感器的高綠/紅熒光比通常指示高糖酵解活性；而低熒光比則表明糖酵解活性較低。
生物傳感器作用效果的自動化圖像分析流程
我們此案例使用 Agilent BioTek Cytation 5 多模式細胞成像系統(tǒng)和 Gen5 軟件，對 Peredox 熒光生物傳感器進行自動圖像分析和定量，如圖 3 所示。
Step1：
為了保證單細胞分析的準確度，需要使用Cytation 的 20X 以上的物鏡捕獲綠色和紅色發(fā)射通道圖像，并在 Gen5 軟件中自動進行細胞識別分割（黃色輪廓）。
Step2：
計算并繪制每個孔中所有已識別的細胞核的絕對綠/紅強度比值，軟件可繪制圖像水平的頻率-柱狀圖。
Step3：
在多孔板矩陣視圖中顯示 96 孔微孔板中每個孔的絕對綠/紅強度比平均值，輸出孔水平的可視化色彩梯度圖像。
Step4：
Gen5 軟件可使用低傳感器狀態(tài)的孔的結(jié)果作為對照值，將絕對綠紅強度比執(zhí)行自動標準化操作，從而提供整個板上的標準化傳感器信號比。
Step5：
軟件繪制標準化的 8 點校準曲線，自動計算EC50 值（紅色虛線），對應(yīng)的 Kr 值約為 100。最后，Gen5 軟件將使用校準曲線和實驗樣品孔的標準化綠紅比率自動量化 NAD+/NADH 比率，以上結(jié)果與 Peredox-mCherry 已公布的響應(yīng)特征非常一致。
方案優(yōu)勢及拓展
通過本文介紹的比例熒光生物傳感器的自動成像與分析方案，能夠定量細胞內(nèi)的 NAD+/NADH 比率，研究者可以評估藥物處理是否顯著改變了細胞的代謝反應(yīng)，用于建立自動化藥物及篩選方案，通過 Cytation5 的單一平臺，能夠建立標準方案，通過方案調(diào)用檢測，可實現(xiàn)評價流程的標準化操作，減少人為因素的干擾，極大節(jié)約人力物力成本。
除此之外，一些研究需要更定量的方法，并希望將標準化傳感器比率轉(zhuǎn)換為分析物水平（例如胞質(zhì) NAD+/NADH 比率），此類校準有些情況可以在活細胞中進行，對于 Peredox，可以使用已建立的方法在活細胞的整個響應(yīng)范圍內(nèi)進行信號校準，以精確評價細胞內(nèi) NAD+/NADH 比率，Cytation5 可搭載適用于活細胞檢測的氣體控制系統(tǒng)，用于此類方案的開發(fā)。
最后，在活細胞能量的代謝領(lǐng)域，安捷倫還能夠提供 Seahorse XF 活細胞能量代謝分析儀，通過實時監(jiān)測細胞的氧消耗率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR），能夠同時分析活細胞中的糖酵解和線粒體功能。而 Cytation5 平臺和 Seahorse XF 系統(tǒng)聯(lián)合使用，可以實現(xiàn)從代謝活性到細胞形態(tài)、功能的全面分析。感興趣的讀者，歡迎隨時和我們聯(lián)系獲取更多應(yīng)用方案。
在探索活細胞代謝的科研工作中，使用基因編碼的熒光生物傳感器幫助科學(xué)家觀察細胞內(nèi)的關(guān)鍵代謝物的實時變化，不斷革新著我們對細胞內(nèi)部動態(tài)的理解，為疾病機制解析開辟了新路徑；此外，熒光生物傳感器還展現(xiàn)出了高通量、高內(nèi)涵藥物篩選的巨大應(yīng)用潛力，在藥物研發(fā)過程中，幫助研究者更快地找關(guān)鍵靶點，加速新藥的研發(fā)進程，為患者帶來福音。今天和大家分享一套解決方案，該方案通過 Agilent BioTek Cytation 成像平臺以高通量方式利用基因編碼的生物傳感器進行活細胞研究。
NAD+/NADH 熒光生物傳感器
NAD+/NADH 在多個細胞區(qū)室中扮演眾多角色，其中最重要的功能與線粒體能量產(chǎn)生相關(guān)，它們通過相互轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的有氧和無氧代謝過程。NAD+ 接受電子和氫離子形成還原型 NADH，這一過程是 ATP 生成的關(guān)鍵步驟。目前已經(jīng)開發(fā)出多種能夠在活細胞水平檢 NAD+/NADH 的熒光生物傳感器，比如 SoNar、Peredox 和 iNap 等工具，本案例中采用的 Peredox 傳感器將綠色熒光蛋白的亮度與 NADH 的相對豐度耦合在一起，因此隨著 NAD+/NADH 增加，Peredox 的綠色強度也會增加；此外，Peredox 設(shè)計還包括第二個穩(wěn)定的 mCherry 熒光蛋白作為參考信號，這樣綠光與紅光發(fā)射強度的比值使得 Peredox 報告信號獨立于傳感器表達水平。與強度設(shè)計相比，比率生物傳感器在定量分析方面具有優(yōu)勢，因此，本案例中涉及的自動化策略同樣適應(yīng)其他比例生物傳感器的使用，例如 FRET 傳感器，SoNar 傳感器等。
基于圖像的生物傳感器的高通量檢測流程
由于 NAD+/NADH 比率型熒光生物傳感器的設(shè)計特點通常包括兩種熒光蛋白，能夠提供穩(wěn)定而明亮的細胞內(nèi)熒光信號，非常適合于基于圖像的高通量檢測，一般來說，需要檢測設(shè)備具有多通道、多孔位的自動化圖像采集及圖像分析能力，安捷倫的 Cytation&Gen5 自動化圖像處理平臺能夠為此類比率熒光生物傳感器提供優(yōu)異的檢測性能，主要工作流程如圖 1 所示：包括生物傳感器細胞內(nèi)表達、細胞接種及藥物處理條件優(yōu)化、Cytation 自動化成像平臺圖像采集、Gen5 軟件熒光信號單細胞分析、藥物劑量響應(yīng)曲線擬合和結(jié)果輸出等環(huán)節(jié)。
圖 1：活細胞熒光生物傳感器的多通道高通量圖像分析工作流程
細胞內(nèi) NAD+/NADH 的可視化檢測
Peredox-mCherry-NLS 生物傳感器在活體 MCF10A 細胞中可視化狀態(tài)如圖 2 所示。當 Peredox 傳感器與 NAD+ 結(jié)合時，綠色熒光信號較暗，而當 Peredox 與 NADH 結(jié)合時，綠色熒光信號較亮。因此，熒光色通道中 Peredox 的強度表示 NAD+/NADH 比率，同時用 mCherry 的紅色熒光信號做傳感器總量的標準化處理。
圖2：生物傳感器多通道成像和傳感器可視化狀態(tài)示意圖
通過在培養(yǎng)基中添加特定比例的超生理濃度（10 mM）乳酸和丙酮酸，能夠調(diào)控細胞內(nèi) NAD+/NADH 的比例，此方法已經(jīng)被驗證能夠有效將綠紅熒光比的變化轉(zhuǎn)換為胞質(zhì) NAD+/NADH 的比率。圖 2 的上一行圖像中，細胞處于 NAD+/NADH 低的培養(yǎng)基條件，而圖像的下一行展示了細胞內(nèi)高 NAD+/NADH 的培養(yǎng)基條件。
在生理條件下，胞質(zhì)糖酵解速率是影響 NAD+/NADH 比率的主要因素。葡萄糖通過糖酵解生成丙酮酸、ATP 和 NADH。在 MCF10A 細胞中，Peredox 傳感器的高綠/紅熒光比通常指示高糖酵解活性；而低熒光比則表明糖酵解活性較低。
生物傳感器作用效果的自動化圖像分析流程
我們此案例使用 Agilent BioTek Cytation 5 多模式細胞成像系統(tǒng)和 Gen5 軟件，對 Peredox 熒光生物傳感器進行自動圖像分析和定量，如圖 3 所示。
Step1：
為了保證單細胞分析的準確度，需要使用Cytation 的 20X 以上的物鏡捕獲綠色和紅色發(fā)射通道圖像，并在 Gen5 軟件中自動進行細胞識別分割（黃色輪廓）。
Step2：
計算并繪制每個孔中所有已識別的細胞核的絕對綠/紅強度比值，軟件可繪制圖像水平的頻率-柱狀圖。
Step3：
在多孔板矩陣視圖中顯示 96 孔微孔板中每個孔的絕對綠/紅強度比平均值，輸出孔水平的可視化色彩梯度圖像。
Step4：
Gen5 軟件可使用低傳感器狀態(tài)的孔的結(jié)果作為對照值，將絕對綠紅強度比執(zhí)行自動標準化操作，從而提供整個板上的標準化傳感器信號比。
Step5：
軟件繪制標準化的 8 點校準曲線，自動計算EC50 值（紅色虛線），對應(yīng)的 Kr 值約為 100。最后，Gen5 軟件將使用校準曲線和實驗樣品孔的標準化綠紅比率自動量化 NAD+/NADH 比率，以上結(jié)果與 Peredox-mCherry 已公布的響應(yīng)特征非常一致。
圖 3：使用安捷倫 Cytation5 和 Gen5 圖像分析軟件開展生物傳感器作用效果的自動化圖像分析流程
方案優(yōu)勢及拓展
通過本文介紹的比例熒光生物傳感器的自動成像與分析方案，能夠定量細胞內(nèi)的 NAD+/NADH 比率，研究者可以評估藥物處理是否顯著改變了細胞的代謝反應(yīng)，用于建立自動化藥物及篩選方案，通過 Cytation5 的單一平臺，能夠建立標準方案，通過方案調(diào)用檢測，可實現(xiàn)評價流程的標準化操作，減少人為因素的干擾，極大節(jié)約人力物力成本。
除此之外，一些研究需要更定量的方法，并希望將標準化傳感器比率轉(zhuǎn)換為分析物水平（例如胞質(zhì) NAD+/NADH 比率），此類校準有些情況可以在活細胞中進行，對于 Peredox，可以使用已建立的方法在活細胞的整個響應(yīng)范圍內(nèi)進行信號校準，以精確評價細胞內(nèi) NAD+/NADH 比率，Cytation5 可搭載適用于活細胞檢測的氣體控制系統(tǒng)，用于此類方案的開發(fā)。
最后，在活細胞能量的代謝領(lǐng)域，安捷倫還能夠提供 Seahorse XF 活細胞能量代謝分析儀，通過實時監(jiān)測細胞的氧消耗率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR），能夠同時分析活細胞中的糖酵解和線粒體功能。而 Cytation5 平臺和 Seahorse XF 系統(tǒng)聯(lián)合使用，可以實現(xiàn)從代謝活性到細胞形態(tài)、功能的全面分析。感興趣的讀者，歡迎隨時和我們聯(lián)系獲取更多應(yīng)用方案。
SeahorseXF 分析儀與 Cytation 多模式平臺聯(lián)合應(yīng)用
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關(guān)于安捷倫細胞分析
安捷倫細胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細胞分析儀、NovoCyte系列流式細胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強大分析工具，提供多方位的細胞效力檢測和深度的細胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
安捷倫細胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細胞分析儀、NovoCyte系列流式細胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強大分析工具，提供多方位的細胞效力檢測和深度的細胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
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