自動化成像平臺如何助力神經(jīng)突起生長分析研究
內(nèi)容摘要
實驗設(shè)計
結(jié)果與討論
Cytation 5 and BioSpa 8 automated incubator
Figure 1. Agilent BioTek imagers support two label-free imaging techniques for live-cell neuron analysis.
實時活細(xì)胞成像動態(tài)定量神經(jīng)突起生長
Cytation 5 cell imaging multimode reader
- 突觸生長試驗?zāi)軌驗榘l(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)毒性、退行性疾病以及神經(jīng)再生研究等領(lǐng)域中神經(jīng)元模型的關(guān)鍵表型變化提供深刻見解。
- 自動化方法憑借提高通量、效率及可重復(fù)性，推動了神經(jīng)突起生長研究的進(jìn)步。
- 安捷倫 BioTek 自動化成像儀與 Gen5 軟件的突觸分析功能相互結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)針對多種突觸生長實驗方法的高通量研究。
- 多模態(tài)神經(jīng)突起生長試驗可以提供有關(guān)藥物治療后復(fù)雜生長效應(yīng)的協(xié)同和互補(bǔ)性見解。
實驗設(shè)計
- 神經(jīng)元培養(yǎng)：培養(yǎng) iPSC 誘導(dǎo)的神經(jīng)元(FUJIFILM iCell GlutaNeurons)。常規(guī) 2D 實驗，以每孔 10,000 個細(xì)胞的密度將神經(jīng)元接種于包被 poly-ornithine 的 96 孔微孔板(Greiner)。3D 實驗組則以每孔 3,000 個細(xì)胞的密度將神經(jīng)元接種在 96 孔球型培養(yǎng)板(Nunc)中。
- 冷凍保存的小鼠皮層神經(jīng)元(Gibco)在 BrainPhys 培養(yǎng)基(StemCell Technologies)中培養(yǎng)，在包被 poly-ornithine 的 96 孔微孔板(Greiner)上以約 10000 個細(xì)胞/孔的密度接種。
- 神經(jīng)元標(biāo)記：固定神經(jīng)元細(xì)胞，使用 β-III-tubulin (Invitrogen)，MAP2和DAPI (Invitrogen)進(jìn)行標(biāo)記。使用 Calcein green AM (Invitrogen)和 Hoechst 33342 對活體神經(jīng)元球體進(jìn)行標(biāo)記。
- 成像：在 Agilent BioTek Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)和 Agilent BioTek BioSpa 8 自動化培養(yǎng)箱組成的智能活細(xì)胞工作站上進(jìn)行活細(xì)胞實時成像。在 Cytation 5 成像儀上進(jìn)行固定細(xì)胞成像，在 Cytation C10 共聚焦成像系統(tǒng)進(jìn)行 3D 活細(xì)胞生長監(jiān)測。
- 分析：圖像采集和數(shù)據(jù)分析通過安捷倫 BioTek Gen5 神經(jīng)突起生長模塊進(jìn)行。
結(jié)果與討論
非標(biāo)記動力學(xué)神經(jīng)突生長
分析方法：
Cytation 5 and BioSpa 8 automated incubator
- 神經(jīng)元于 96 孔微孔板中培養(yǎng)，并在五天內(nèi)每隔三個小時進(jìn)行一次成像。
- 針對四種處理在六個濃度下的活細(xì)胞動力學(xué)展開分析。
Figure 1. Agilent BioTek imagers support two label-free imaging techniques for live-cell neuron analysis.
實時活細(xì)胞成像動態(tài)定量神經(jīng)突起生長
Figure 2. Detailed kinetic analysis of neuron culture outgrowth assessed by total neurite length across five days in culture.
藥物作用時間：生長率變化分析
Figure 3. Differences in drug effect timing established through kinetic analysis. The maximum rate of change in outgrowth is determined by Gen5 software analysis and highlighted for each drug. Data points represent mean and SEM for replicate conditions (n =3).
基于免疫熒光標(biāo)記的神經(jīng)突起生長
分析方法：
Cytation 5 cell imaging multimode reader
- 神經(jīng)元于 96 孔微板中培養(yǎng)，并以四種藥物在六個濃度下加以處理。
- 歷經(jīng)五天的培養(yǎng)之后，將細(xì)胞固定，進(jìn)行免疫熒光染色，以標(biāo)記 MAP2、β-III-tubulin，及 DAPI 核染。
自動化多通道成像與分析
Figure 4. Multichannel image acquisition and automated neurite analysis.
iPSC 衍生的神經(jīng)元生長定量分析
Figure 5. Neurite outgrowth analysis of iPSC-derived cultures across drug treatments.
Figure 4. Multichannel image acquisition and automated neurite analysis.
iPSC 衍生的神經(jīng)元生長定量分析
Figure 5. Neurite outgrowth analysis of iPSC-derived cultures across drug treatments.
大鼠皮層神經(jīng)元生長分析
Figure 6. Neurite outgrowth analysis of mouse cortical cultures across drug treatments.
活細(xì)胞 3D 神經(jīng)元球體中的神經(jīng)突起生長
分析方法：
Cytation C10 confocal imaging reader
- 神經(jīng)元球體于圓底 ULA 96 孔微板中形成，隨后被轉(zhuǎn)移至 ECM 涂層的 96 孔板以進(jìn)行生長評估。
- 轉(zhuǎn)移 48 小時后，采用 calcein AM 染色，用于活細(xì)胞生長分析。
iPSC 來源的神經(jīng)元球體的活細(xì)胞生長
Figure 7. Live-cell staining identifies neuron processes for outgrowth evaluations in iPSC-derived neuron spheroid cultures.
3D 神經(jīng)元生長模型中的藥物效應(yīng)評估
Figure 8. Confocal imaging captures and quantifies treatment effects on 3D neuron spheroid outgrowth.
總結(jié)
安捷倫 BioTek 自動化智能化成像系統(tǒng)結(jié)合 Gen 5 軟件展現(xiàn)出了在一系列實驗方法中對神經(jīng)突起生長進(jìn)行靈敏且穩(wěn)健定量分析的能力。Gen5 神經(jīng)突起生長分析軟件可自動為無標(biāo)記和熒光突起生長分析提供關(guān)鍵的形態(tài)參數(shù)。強(qiáng)大的下游軟件分析工具為時間依賴性和濃度依賴性治療效果給出了定量性的見解。
總結(jié)
安捷倫 BioTek 自動化智能化成像系統(tǒng)結(jié)合 Gen 5 軟件展現(xiàn)出了在一系列實驗方法中對神經(jīng)突起生長進(jìn)行靈敏且穩(wěn)健定量分析的能力。Gen5 神經(jīng)突起生長分析軟件可自動為無標(biāo)記和熒光突起生長分析提供關(guān)鍵的形態(tài)參數(shù)。強(qiáng)大的下游軟件分析工具為時間依賴性和濃度依賴性治療效果給出了定量性的見解。
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關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、Novocyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
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