非層狀液晶脂質(zhì)納米顆粒與細(xì)胞外囊泡雜交實(shí)現(xiàn)核酸分子高效裝載的研究

近年來，mRNA 疫苗和 siRNA 藥物等 RNA 療法發(fā)展迅猛，取得了顯著的臨床進(jìn)展，如 COVID-19 疫苗、Onpattro 和 Spinraza 等突破性藥物的獲批上市。然而，核酸藥物在體內(nèi)的高效遞送仍是關(guān)鍵挑戰(zhàn)。常用的脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles, LNPs）載體雖然具備易于生產(chǎn)和載藥量高等優(yōu)勢(shì)，但仍受限于靶向性不足和免疫原性等問題。

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）作為一種天然存在的細(xì)胞分泌囊泡，具備低免疫原性、良好的生物相容性和潛在的靶向性，被認(rèn)為是理想的藥物遞送載體。有證據(jù)表明：相比于 LNPs，EVs 可以更安全和高效地遞送核酸。然而，如何將治療性核酸藥物有效裝載到 EVs 內(nèi)部仍然是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)。通過對(duì)生產(chǎn) EVs 的細(xì)胞系進(jìn)行基因工程改造來裝載蛋白質(zhì)或核酸是一種廣泛應(yīng)用的方法，然而該方法在面對(duì)臨床患者來源的 EVs 時(shí)適用性有限，且難以用于裝載經(jīng)化學(xué)修飾的核酸。另一方面，在 EVs 分離后進(jìn)行載藥的方法，如電穿孔和超聲處理等，則可能對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能造成負(fù)面影響。

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在 Advanced Science 發(fā)表了題為“Loading of Extracellular Vesicles with Nucleic Acids via Hybridization with Non-Lamellar Liquid Crystalline Lipid Nanoparticles”的研究論文。本研究提出了使用非層狀液晶脂質(zhì)納米顆粒（non-lamellar liquid crystalline lipid nanoparticles, LCNPs）與 EVs 自發(fā)雜交形成雜交細(xì)胞外囊泡（HEVs）的新策略，實(shí)現(xiàn)包括 siRNA、mRNA 和核酸適配體在內(nèi)的多種核酸分子的高效裝載，同時(shí)保持 EVs 的生物學(xué)功能。這一雜交體系的體外裝載效率遠(yuǎn)高于它的“前輩”——LCNPs，有望進(jìn)一步拓展至更廣泛的細(xì)胞來源甚至實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

一、LCNPs 的制備與表征
研究人員采用可電離脂質(zhì) DLin-MC3-DMA（MC3）、輔助脂質(zhì) DOPE 和非離子表面活性劑 HS15 制備了非層狀液晶脂質(zhì)納米顆粒（LCNPs）。通過小角 X 射線散射 (small-angle X-ray scattering, SAXS) 和冷凍透射電鏡分析 LCNPs 的結(jié)構(gòu)特性，發(fā)現(xiàn) LCNPs 在 pH 5 時(shí)呈現(xiàn)反六角相（HII 相），而在 pH 7.4 時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼰o序的非層狀相（可能是反向膠束 L2 或海綿相 L3），表明 LCNPs 具有 pH 依賴性的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變行為（圖 1）。

圖1. LCNPs 的理化特征

二、HEVs 的形成與表征
研究人員從 3D 培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）中分離 EVs，并依照 ISEV 指南建議的多種技術(shù)手段表征 EVs 的質(zhì)量。隨后，深入研究了 EVs 與 LCNPs 雜交形成 HEVs 的動(dòng)力學(xué)。靜態(tài)光散射（SLS）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）的結(jié)果顯示，EVs 與 LCNPs 混合后，顆粒濃度呈指數(shù)衰減，并在 30 min 后趨于穩(wěn)定。同時(shí)，粒徑在 30 min 內(nèi)從 160 nm 增大至 190 nm 并趨于穩(wěn)定，表明雜交過程迅速進(jìn)行。冷凍透射電鏡（cryo-TEM）直觀地觀察了雜交的過程，如圖 2 所示，混合后 5 分鐘內(nèi)，半融合的 HEVs 已然出現(xiàn)；4 小時(shí)之后，幾乎全部形成了完全融合的 HEVs，且 EV 膜蛋白依然分布于顆粒表面。此外，研究者還探究了溫度和 pH 對(duì)雜交動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明，在 37℃ 時(shí)，雜交過程更為迅速；而在 4℃ 時(shí)，動(dòng)力學(xué)顯著減緩。在酸性條件下（pH ≤ 6）EVs 與 LCNPs 之間的相互作用更為強(qiáng)烈，導(dǎo)致粒徑急劇增大，可能促使大聚集體的形成。

圖2. cryo-TEM 成像觀察 HEVs 的形成

進(jìn)一步地，采用納米流式檢測(cè)技術(shù)（NanoFCM）在單顆粒水平上探究脂質(zhì)納米載體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如何影響其與 EV 的相互作用。研究人員選取三種不同類型的脂質(zhì)納米載體（LCNPs、DOPC-NPs 和 DOTMA-NPs），分別裝載了熒光標(biāo)記的小核酸（FAM-siRNA），并與 CellTrace Red 標(biāo)記的 EVs 以 1:1 比例混合。NanoFCM 的結(jié)果顯示，不同類型的 NPs 與 EVs 混合后，均形成了不同比例的雙陽性亞群，證實(shí) HEVs 的形成（圖 3A 中以青綠色方框突出顯示）。進(jìn)一步分析雙陽性顆粒計(jì)數(shù)相對(duì)于 CellTrace 群體的比例，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，與高度正電荷的納米顆粒（如 LCNPs 或 DOTMA-NPs）形成的 HEVs，分別達(dá)到了 57% 和 53% 的最高共定位率。而在 pH 7.4 下，LCNPs 與 EVs 的相互作用效率降至 40%；相比之下，DOPC-NPs 與 EVs 的相互作用效率最低，僅為 12%（圖 3B)。這表明 NPs 的表面電荷、脂質(zhì)組成以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)其與 EVs 的相互作用均有顯著影響。此外，研究人員通過不同類型的核酸載物（mRNA 和核酸適配體）來評(píng)估 HEVs 的形成，進(jìn)一步驗(yàn)證 HEVs 平臺(tái)裝載多種類型的核酸分子的有效性和普適性。

圖3. NanoFCM 分析不同條件下 HEVs 的形成

三、HEVs 的生物學(xué)特性
為了探究 EVs 膜蛋白是否存在于 HEVs 表面以及 LCNPs 是否傾向于與特定的 EVs 亞群相互作用，研究人員利用光流體平臺(tái)的免疫親和捕獲和熒光顯微技術(shù)進(jìn)行評(píng)估。

研究人員選擇了多種 EV 和 MSC 特征膜蛋白的抗體作為捕獲探針，結(jié)果顯示，EVs 和 HEVs 的膜蛋白表達(dá)譜沒有顯著差異，且呈現(xiàn) CD26 >> CD73 > CD9 > CD63 > IgG 的相對(duì)趨勢(shì)（圖 4C）。此外，不同膜蛋白與核酸的共定位比例均在 30%~40% 之間，這個(gè)結(jié)果與 NanoFCM 的結(jié)果互相印證（圖 4D）。這表明 LCNPs 與 EVs 的雜交過程是非特異性的，不偏好任何特定的 EV 亞群。

進(jìn)一步地，對(duì)膜蛋白的生物活性及核酸載物的完整性進(jìn)行了驗(yàn)證。酶活性實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn) HEVs 的 CD73 和 CD26 酶活性與天然 EVs 有顯著差異（圖 4E, F)。此外，HEVs 的結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)核酸載物免受降解。

圖4. HEVs 生物學(xué)特性的綜合表征

四、HEVs 的基因遞送功能
研究人員以 HeLa 細(xì)胞作為模型，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）或熒光素酶（FLuc）的細(xì)胞株，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染 siRNA 或 mRNA 的質(zhì)粒以評(píng)估 HEVs 和 LCNPs 的基因沉默和基因表達(dá)效率。
1）在基因沉默實(shí)驗(yàn)中，裝載 siGFP 的 HEVs 于低血清條件下可使 GFP 熒光強(qiáng)度降低約 75%，其沉默效率與商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑相當(dāng)（圖 5A）；即使在高血清條件下，經(jīng)過 4 小時(shí)處理，裝載 siGFP 的 HEVs 仍能顯著降低 GFP 熒光強(qiáng)度約 15%（圖 5B）。
2）在基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，低血清條件下，裝載 mRNA 的 HEVs 即使在較低 mRNA 劑量下仍可誘導(dǎo)較高的熒光素酶表達(dá)水平（圖 5C）；而在高血清條件下，即便在較高的 mRNA 劑量下，該載體系統(tǒng)仍能實(shí)現(xiàn)顯著增強(qiáng)的熒光素酶表達(dá)（圖 5D）。

上述結(jié)果表明，HEVs 的體外基因沉默和基因表達(dá)效率均優(yōu)于傳統(tǒng)的 LCNPs。

圖5. HEVs 在體外的基因沉默和基因表達(dá)效率

結(jié)論
本研究開發(fā)了一種新型非層狀液晶脂質(zhì)納米顆粒與 EVs 的雜交策略，獲得的雜交 EVs 成功實(shí)現(xiàn)了核酸的高效裝載。這一策略在避免了傳統(tǒng)方法對(duì) EVs 結(jié)構(gòu)影響的前提下，顯著提高了核酸的裝載效率，同時(shí)保留了 EVs 的生物活性。這一多功能平臺(tái)展現(xiàn)了將各種治療性藥物裝載到 EVs 中的巨大潛力，為開發(fā)基于 EV 的基因遞送系統(tǒng)開辟了新的路徑。

展 望
NanoFCM 憑借卓越的散射和熒光靈敏度，在單顆粒水平解析了 HEVs 的粒徑分布、濃度、融合效率和膜蛋白表達(dá)等多維信息。這使得研究者能夠精確監(jiān)測(cè) EVs 與 LCNPs 的雜交過程，并高效評(píng)估了多種非編碼 RNA 分子（即 mRNA、siRNA 和核酸適配體）載入 EVs 的效率。NanoFCM 的單顆粒多參數(shù)表征能力為深入探究生物雜交載體平臺(tái)提供了有力支持，進(jìn)而推動(dòng)基于 EVs 的基因遞送系統(tǒng)的發(fā)展。