DNA甲基化在哺乳動物胚胎發(fā)育和疾病中的多種重要作用
DNA甲基化參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育、X染色體失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生，對哺乳動物胚胎發(fā)育至關(guān)重要，近年來更被發(fā)現(xiàn)是解碼衰老機制的關(guān)鍵“時鐘”。DNA甲基化水平隨齡動態(tài)變化，其異常既可驅(qū)動干細胞耗竭、線粒體功能障礙等衰老標(biāo)志，也可作為預(yù)測個體生物學(xué)年齡的指標(biāo)，為衰老干預(yù)提供可量化的時間窗口。近日，法國巴黎文理研究大學(xué)居里研究所Maxim V. C. Greenberg和Deborah Bourc’his在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》上發(fā)表題為《The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease》的深度綜述。文章從DNA甲基化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、DNA甲基化相關(guān)基因在DNA甲基化過程中的作用及疾病中的可能機制等方面，討論了在富含CpG的啟動子、基因體和轉(zhuǎn)座元件中，小鼠和人類DNA甲基化和去甲基化的機制和功能，強調(diào)了在胚胎、生殖細胞系和體細胞發(fā)育過程中DNA甲基化的時序性去除和再建立，并對復(fù)雜疾病的表觀遺傳基因突變關(guān)聯(lián)進行了闡述。
本文深入剖析了DNA甲基化在哺乳動物發(fā)育與疾病中的多重角色，為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域提供了前沿且全面的視角。不僅闡釋了DNA甲基化在基因調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件沉默及基因組穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用，還揭示了其在胚胎發(fā)育、生殖細胞系分化等過程中的時序性變化與復(fù)雜機制力。此外，對表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病關(guān)系（包括理解衰老的發(fā)生機制）的解讀，為臨床診斷與治療提供了理論基礎(chǔ)。
（DOI:10.1038/s41580-019-0159-6）
一、DNA甲基化的細胞功能
（1）甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶" writers "與去甲基化酶" erasers "
DNA甲基化過程分為de novo甲基化（建立）、維持和去甲基化三個階段。
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶“writers”
DNMT3A和DNMT3B：兩種主要的de novo DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMTs），其包含高度保守的DNMT域（MTase domain）和兩個染色質(zhì)read域：ATRX-DNMT3-DNMT3L（ADD）和PWWP域(圖1a,b；表1)。ADD域可與H3K4me3結(jié)合，其與H3K4的甲基化程度呈負相關(guān)，當(dāng)H3K4未甲基化時，ADD域釋放MTase域的自抑制，從而允許DNA甲基化發(fā)生；PWWP域能與H3K36me3結(jié)合，這表明轉(zhuǎn)錄與基因體（gene body）的DNA甲基化之間存在機制聯(lián)系。
DNMT3L：是一種無催化活性的DNMT，它與DNMT3A和DNMT3B相互作用并特異性地在生殖細胞系中刺激它們的活性。
DNMT1：是維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其活性依賴于UHRF1蛋白。UHRF1通過其SRA域特異性結(jié)合復(fù)制叉上的半甲基化CpG二核苷酸，還通過TTD-PHD域結(jié)合H3K9me2和H3K9me3。UHRF1通過其UBL域招募DNMT1，釋放其自抑制狀態(tài)，使DNMT1能夠結(jié)合RFTS并甲基化子代DNA鏈。
DNA去甲基化酶" erasers "
TET蛋白（TET methylcytosine dioxygenases）：是主動DNA去甲基化的執(zhí)行蛋白，其逐步將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），這些氧化產(chǎn)物都能在復(fù)制過程中促進DNA去甲基化，5fC和5caC還可以通過TDG介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路發(fā)生去甲基化。
b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制�；钴S轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過其SRA域（識別半甲基化CpG位點）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點的對稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點會阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；傅刃纬蓮�(fù)合物，促進基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制。活躍轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過其SRA域（識別半甲基化CpG位點）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點的對稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點會阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；傅刃纬蓮�(fù)合物，促進基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
（3）CpG島啟動子(CpG-island promoters)
CpG島（CGIs）是哺乳動物基因組中相對較短的基因組區(qū)域，平均約1kb，其CpG含量較高，超過三分之二的哺乳動物啟動子是CGIs，幾乎所有管家基因和一些發(fā)育調(diào)控基因都有CGI啟動子。CGIs通常很少發(fā)生甲基化，尤其是在分裂的雄性生殖細胞系中，它們未被CpG侵蝕，保留了較高的CpG含量。
X-chromosome inactivation（X染色體失活）：在雌性哺乳動物中，每個細胞中的一條X染色體會被隨機沉默，這一過程由非編碼RNA X- inactive specific transcript（XIST）在順式（in cis）中發(fā)揮作用。在X染色體失活過程中，DNA甲基化出現(xiàn)在相對較晚的階段，作為基因沉默后的最終鎖定機制。在小鼠中，X連鎖CGI啟動子的沉默主要依賴于DNMT3B，而SMCHD1在部分X連鎖CGI中也發(fā)揮重要作用，但其在人類中與DNA甲基化的聯(lián)系尚未明確。
Genomic imprinting（基因組印記）：基因組印記是指在兩個親本生殖細胞系中差異性地建立DNA甲基化模式，這些印記模式能夠抵抗早期胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的重編程。在小鼠和人類中，大約有20個基因組印記調(diào)控區(qū)域（ICRs）能夠抵抗這種重編程，從而強制相鄰基因單等位表達。ICRs大多在卵子中被甲基化，且都與極富CpG的CGIs重合，而三個父本ICRs則位于CpG貧乏的基因間序列中。在卵母細胞生長過程中，DNMT3A在DNMT3L的輔助下以轉(zhuǎn)錄依賴性方式甲基化卵母細胞表達基因的基因體，包括其內(nèi)含的CGIs（圖2b），而基因組的其余部分則保持低甲基化狀態(tài)。哺乳動物卵母細胞轉(zhuǎn)錄通常從位于典型CGI啟動子上游的替代啟動子發(fā)出，這些啟動子通常與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件序列重合。
母本(也包括父本)ICRs與其他在配子中被甲基化的序列區(qū)別在于它們富含特定的遺傳motif(TGCCGC)，這些motif在發(fā)生甲基化時會被KRAB鋅指蛋白57(ZFP57)識別。ZFP57招募KRAB相關(guān)蛋白1(KAP1，也稱為TIF1β)和其他沉默因子，包括DNMTs�？傊�，母本印記CGI能夠發(fā)生DNA甲基化，依賴于卵母細胞的特異性轉(zhuǎn)錄譜和特定的遺傳序列的共同作用。
Germline-specific genes（生殖細胞系特異性基因）：CGI啟動子的生殖細胞系特異性基因通過DNMT3B介導(dǎo)的DNA甲基化在胚胎植入后隨著體細胞分化開始被沉默。與大多數(shù)未甲基化的CpG富集啟動子不同，生殖細胞系CGIs進化出了序列特異性地招募DNA甲基化機制以確保終體細胞沉默的方式(圖2c)。
b.母源印記的建立。在生長中的卵母細胞中，DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄延伸過程密切相關(guān)，依賴DNMT3A-DNMT3L復(fù)合體。小鼠受精后，印記啟動子通過結(jié)合鋅指蛋白57（ZFP57）-KRAB相關(guān)蛋白1（KAP1）復(fù)合體上的甲基化TGCCGC motif，抵抗早期胚胎的整體去甲基化。該復(fù)合體招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1及維持甲基化因子DNMT1和UHRF1，從而維持基因沉默。
c.生殖細胞系基因CGI啟動子的甲基化模型。部分生殖細胞系基因被非經(jīng)典多梳抑制復(fù)合體PRC1.6結(jié)合，該復(fù)合體包含L3MBTL2，可招募異二聚體H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9a-GLP。
（4）利用重復(fù)基因組
基因組防御轉(zhuǎn)座元件被認為是DNA甲基化進化的驅(qū)動力之一，哺乳動物基因組中DNA甲基化的主要靶標(biāo)不是基因而是轉(zhuǎn)座元件，尤其是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件。小鼠和人類基因組中有數(shù)百萬個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件拷貝，占據(jù)了大約一半的基因組空間。在小鼠Dnmt1敲除胚胎中，內(nèi)源性A粒子（IAP）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件被大量去抑制，導(dǎo)致嚴重的發(fā)育缺陷和胚胎致死(圖3a)。
DNMT3C是一種新發(fā)現(xiàn)的de novo DNMT，它在小鼠和大鼠的Muroidea譜系中通過串聯(lián)重復(fù)Dnmt3b基因起源。DNMT3C在雄性胎兒生殖細胞系中特異性表達，它選擇性地甲基化和抑制進化上年輕的轉(zhuǎn)座元件啟動子，這些轉(zhuǎn)座元件僅占小鼠基因組的1%。Dnmt3c突變小鼠表現(xiàn)出小睪丸和不育，其分子表型與生殖細胞系甲基化輔助因子Dnmt3l的突變體以及piRNA通路的突變體相同，piRNA通路是一類專門用于在生殖細胞系中沉默轉(zhuǎn)座元件的高度保守的小RNA。
除了短期內(nèi)抑制轉(zhuǎn)座元件表達外，DNA甲基化還通過脫氨基引起的突變促進它們的不可逆遺傳失活。此外，DNA甲基化可能通過限制非等位轉(zhuǎn)座元件拷貝之間的重組來維持基因組穩(wěn)定性，這一可能性得到了各種人類癌癥中DNA低甲基化與染色體重排（大多涉及轉(zhuǎn)座元件）之間正相關(guān)的支持。
圖3：基于DNA甲基化的轉(zhuǎn)座元件調(diào)控機制
a.體內(nèi)DNA甲基化缺失對轉(zhuǎn)座元件的功能作用。在小鼠胚胎中，DNMT1缺失會導(dǎo)致胞內(nèi)A顆粒（IAP）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的顯著上調(diào)，并伴隨嚴重的發(fā)育缺陷和胚胎期9.5天（E9.5）的致死性。Dnmt3C或Dnmt3L突變體會導(dǎo)致睪丸縮小，并在雄性生殖細胞系中特異性喪失IAP和LINE1轉(zhuǎn)座元件的DNA甲基化，進而引發(fā)減數(shù)分裂災(zāi)難和不育。
b.piRNA介導(dǎo)的小鼠DNA甲基化模型。由轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)錄本生成的piRNA會裝載到MIWI2（即PIWIL4）上并定位至細胞核，通過未知機制招募DNMT3C-DNMT3L復(fù)合體。由于DNMT3C含有染色質(zhì)read的ADD域，可能存在一種機制（如通過賴氨酸去甲基化酶去除H3K4me3）來規(guī)避H3K4me3基因激活效應(yīng)。
c.小鼠胚胎干細胞（ESCs）中DNA甲基化缺失的補償機制。當(dāng)ESCs從高甲基化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至低甲基化培養(yǎng)基時，轉(zhuǎn)座元件可分為三類：H3K9甲基化未受干擾，但H3K27me3侵入轉(zhuǎn)座元件主體（A類）；H3K9甲基化保持不變（B類）；表觀沉默機制從H3K9甲基化切換為H3K27me3依賴性沉默（C類）。
d.UHRF1在半甲基化DNA中阻止SETDB1介導(dǎo)的IAP沉默。在條件性敲除Dnmt1的胚胎中，UHRF1持續(xù)結(jié)合復(fù)制后的半甲基化DNA，阻止H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1沉默IAP轉(zhuǎn)座元件。這一機制在野生型小鼠胎盤中具有生理意義：UHRF1結(jié)合半甲基化DNA導(dǎo)致IAP去抑制；而在Uhrf1突變的ESCs和胎盤中，SETDB1催化H3K9三甲基化，從而抑制IAP活性。
（5）基因體的謎團
基因體中DNA甲基化的富集提出了一個悖論：一方面，基因體甲基化在真核生物中高度保守，其保守程度甚至超過轉(zhuǎn)座元件；另一方面，DNA甲基化具有誘變性，那么為什么它在編碼序列中如此突出？重要的是，基因體DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，因此其作用與基因沉默無關(guān)。關(guān)于基因體中DNA甲基化功能的兩個假設(shè)被提出：一是促進轉(zhuǎn)錄延伸和/或共轉(zhuǎn)錄剪切，二是其抑制基因內(nèi)隱性啟動子。
轉(zhuǎn)錄延伸和剪切：DNA甲基化在基因體中的分布與外顯子富集有關(guān)，可能影響RNA聚合酶II（Pol II）的進程和剪切。例如，在人類CD45基因中，CCCTC結(jié)合因子（CTCF）減緩?fù)怙@子5處的RNA聚合酶II延伸速率，從而促進其包含；DNA甲基化則阻止CTCF結(jié)合，導(dǎo)致外顯子排除。相反，在其他位點，DNA甲基化可以通過招募MeCP2來促進外顯子包含，這與觀察到的替代外顯子平均甲基化水平低于組成性外顯子的事實一致。
抑制隱秘啟動子：這一假設(shè)與DNA甲基化作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能一致。如上所述，de novo DNA甲基化機制通過結(jié)合H3K36me3被招募到DNA上，而H3K36me3在釀酒酵母中已知可防止隱秘啟動子的使用。然而，基因體中的內(nèi)源性CGIs通常在小鼠和人類之間是保守的，其更可能是替代啟動子而非隱秘啟動子。最近的一項研究顯示，DNMT3B介導(dǎo)的基因體DNA甲基化限制了H3K36me3下游隱秘啟動子活性，但這種效應(yīng)在細胞群體中只在極小比例的細胞中觀察到。此外，Dnmt三敲除胚胎干細胞（ESCs）并未表現(xiàn)出與Dnmt3B單突變細胞相同的內(nèi)源性隱秘啟動子抑制。
二、發(fā)育中的甲基化模式
（1）早期胚胎和生殖細胞系
整體被動和主動去甲基化與局部de novo甲基化
生殖細胞系重編程過程中，DNA去甲基化伴隨著原始生殖細胞系(PGCs)獲得生殖細胞系特性的兩個階段。第一階段包括基因組大部分區(qū)域的被動去甲基化作為默認通路。隨后是TET1和TET2依賴性去甲基化，主要影響印記位點和生殖細胞系特異性基因(圖4a)，并與小鼠PGCs細胞核中5hmC的出現(xiàn)相吻合。
在受精后的重編程中，胚胎在向多能性發(fā)展過程中失去了從卵母細胞和精子遺傳的親本特異性DNA甲基化模式，這一過程也分為兩個階段。在小鼠單細胞期胚胎(受精卵)中，TET3介導(dǎo)的5hmC的出現(xiàn)和5mC的丟失同時發(fā)生，表明父本基因組最初通過TET3主動去甲基化；隨后兩個親本基因組經(jīng)歷幾輪被動的、DNA復(fù)制依賴性DNA甲基化稀釋，因為卵母細胞提供的維持酶DNMT1在隨后的細胞分裂中被排除在細胞核外(圖4a)。然而最近的全基因組亞硫酸鹽測序分析顯示，母本甲基化組在受精卵中也經(jīng)歷了有限的TET3依賴性氧化。其他研究還表明，大多數(shù)受精卵DNA甲基化的丟失與復(fù)制無關(guān)，在父本基因組中，這可能以TET3非依賴性方式通過未知機制發(fā)生。
單細胞全基因組亞硫酸鹽測序（scWGBS）揭示了人類胚胎基因組在進行整體去甲基化時普遍發(fā)生的de novo DNA甲基化：首先在單細胞階段的副本基因組中，然后在8細胞階段全基因組范圍內(nèi)發(fā)生，與胚胎基因組激活同時發(fā)生，主要靶向轉(zhuǎn)座元件。在小鼠發(fā)育過程中，一些de novo DNA甲基化也可能與胚胎或生殖細胞系基因組的整體去甲基化同時發(fā)生。
人類胚胎的DNA甲基化變化與小鼠相似，但也存在一些物種特異性差異。人類胚胎的初始快速去甲基化主要影響父本基因組，但發(fā)生在受精到2細胞階段，而小鼠則在單細胞階段完成。隨后，人類胚胎的全基因組DNA甲基化逐漸丟失，直到囊胚階段，但與小鼠相比，人類母本基因組在囊胚階段保留了更高的DNA甲基化水平。
b.Zdbf2位點的瞬時印記。植入前發(fā)育中，Zdbf2的長轉(zhuǎn)錄本（Liz）呈現(xiàn)印記狀態(tài)：母源等位基因甲基化沉默，父源等位基因未甲基化且表達。兩等位基因的啟動子均通過Polycomb介導(dǎo)的H3K27me3沉默。植入后，父源Liz的表達誘導(dǎo)其啟動子上游區(qū)域甲基化并驅(qū)逐H3K27me3，而母源等位基因仍受H3K27me3抑制。盡管Liz的印記短暫，但父源位點植入后的甲基化通過拮抗Polycomb抑制，實現(xiàn)Zdbf2的終身印記表達。若胚胎中Zdbf2激活失敗，將導(dǎo)致出生后生長缺陷。
c.組織特異性增強子的甲基化變化。體細胞中，調(diào)控元件的DNA甲基化呈現(xiàn)時序性變化。TET酶與轉(zhuǎn)錄因子（TF）協(xié)作介導(dǎo)去甲基化并激活增強子；而失活的增強子因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合減少，更易被de novo甲基化酶靶向。
d.神經(jīng)元中CpA甲基化的作用。出生后，DNMT3A在基因體沉積甲基化。甲基化的CAC序列（mCAC）被MeCP2識別，其結(jié)合可建立基因沉默的終身表觀遺傳記憶。
甲基化重編程及其抵抗的生物學(xué)意義
盡管胚胎和生殖細胞系去甲基化是全局性，但在兩個過程結(jié)束時，仍有相當(dāng)一部分DNA甲基化得以保留。這一現(xiàn)象引發(fā)了關(guān)于代際表觀遺傳繼承甚至跨代表觀遺傳繼承的可能猜想。
在植入前胚胎的內(nèi)細胞團中，小鼠和人類中約20%的CpGs保留了配子遺傳的甲基化(圖4a)。這些位點顯著定位到ICRs，與通過KRAB-ZFP招募KAP1的序列特異性DNA去甲基化抵抗有關(guān)。然而，ICRs在基因組中所占比例微不足道。除了這些經(jīng)典的ICRs外，還有數(shù)百個"瞬時"甲基化印記：這些主要從卵母細胞遺傳，通過類似于經(jīng)典ICRs的KRAB-ZFP依賴性保護，保持母系特異性DNA甲基化直到囊胚階段，并在植入后通過DNA甲基化或再甲基化丟失。這種現(xiàn)象在人類中可能尤為普遍，人類母本基因組在植入前以及植入后（僅在胎盤組織中）保留了比父本基因組更高的DNA甲基化水平。對Zdbf2位點的研究表明，父本等位基因的短暫低甲基化可以通過一系列下游表觀遺傳變化引起長期的印記，從而影響出生后大小。
在囊胚階段，基因組中抵抗重編程的大部分殘余配子甲基化與單拷貝序列無關(guān)，而是與轉(zhuǎn)座元件有關(guān)。在小鼠中，年輕的IAP類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件對植入前甲基化特別抵抗。在人類囊胚中，進化上年輕的、可能活躍的轉(zhuǎn)座元件，特別是靈長類動物特有的SINE-VNTR-Alu元件，保留了最高的DNA甲基化水平。DNA甲基化通過KRAB-ZFP介導(dǎo)的KAP1序列特異性招募保留，類似于KAP1在ICRs中的選擇性DNA結(jié)合。KRAB-ZFPs需要時間來發(fā)展對最近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座元件的匹配，因此最新的IAP元件(通常在小鼠品系之間多態(tài))在植入前發(fā)育過程中不能抵抗DNA甲基化重編程。
與植入前發(fā)育相比，生殖細胞系去甲基化更為廣泛。到小鼠胚胎發(fā)生的第13.5天，PGCs的CpGs甲基化水平僅為6%-8% (圖4a)。人類胎兒生殖細胞系在懷孕9周后也保留了類似的基線水平。與胚胎發(fā)育相反，ICRs在發(fā)育中的PGCs中進行甲基化，作為隨后在雄性和雌性生殖細胞系分化過程中獲得性別特異性DNA甲基化模式的先決條件。與植入前發(fā)育中的甲基化重編程類似，生殖細胞系DNA甲基化的保留主要在年輕且潛在有害的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件中觀察到。
（2）De novo DNA甲基化程序
在PGCs中重編程后，雄性和雌性生殖細胞系中建立了性別特異性的DNA甲基化模式。在配子發(fā)生結(jié)束時，精子基因組表現(xiàn)出約80%的CpG甲基化，而卵子基因組僅約50%被甲基化，且?guī)缀踔辉诨蝮w中(圖4a)。卵母細胞的相對低甲基化與DNMT1在細胞質(zhì)中的保留有關(guān)，這是由于STELLA蛋白將UHRF1隔離在細胞質(zhì)中的次級效應(yīng)。在Stella突變卵母細胞中，DNMT1進入細胞核，導(dǎo)致異位DNA甲基化沉積，DNA甲基化增加兩倍，導(dǎo)致雌性不育。這表明DNMT1在卵母細胞中能夠進行de novo DNA甲基化，而在胚胎細胞中則不然。
在胚胎重編程結(jié)束時(小鼠胚胎第4.5天)，囊胚由內(nèi)細胞團(將形成外胚層然后形成胚胎組織)和滋養(yǎng)外胚層及原始內(nèi)胚層組成。兩項全基因組分析研究證實，與外胚層相比，胚外外胚層(ExE)和內(nèi)臟內(nèi)胚層都是低甲基化的(圖4a)。DNA低甲基化在主要由ExE細胞分化而來的胎盤組織中持續(xù)存在。低甲基化與與外胚層相比DNMT3表達減少相關(guān)，甚至逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件也相對低甲基化。相比之下，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層中甲基化但外胚層中未甲基化的一組特定CGI啟動子。其甲基化增加要么反映了在胚外組織中需要保持被抑制，要么表明胚胎組織有更嚴格的機制來防止異常的DNA甲基化和長期沉默。
大腦在體細胞組織中表現(xiàn)出特殊的甲基化組。在小鼠和人類中，出生后CpA甲基化激增，由DNMT3A產(chǎn)生。神經(jīng)組織中總CpA甲基化水平與CpG甲基化大致相當(dāng)，mCpA頻率低于mCpG。MBD蛋白MeCP2結(jié)合年輕小鼠神經(jīng)元基因體中的mCAC序列，MeCP2的結(jié)合在生命后期保持這些基因的沉默(圖4d)。這一機制可以幫助理解DNA甲基化，特別是非CpG甲基化在調(diào)節(jié)神經(jīng)和行為特征中的作用。
三、表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病的關(guān)系
（1）DNMT1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
DNMT1的雜合突變與一系列常染色體顯性遺傳的進行性認知和行為退化疾病有關(guān)，包括伴有癡呆和聽力損失的遺傳性感覺自主神經(jīng)病1E(HSAN1E)和伴有耳聾和發(fā)作性睡病的常染色體顯性小腦共濟失調(diào)(ADAC-DN)(表1)。
所有DNMT1突變都發(fā)生在RFTS域，導(dǎo)致DNA甲基化模式的輕微變化。對HSAN1E或ADAC-DN個體外周血的全基因組分析結(jié)果顯示主要表現(xiàn)為基因間區(qū)域的低甲基化和一些CGIs的高甲基化。這些DNA甲基化特征可作為可獲取細胞類型中的病理生物標(biāo)志物，但其不一定與疾病的大腦特異性表現(xiàn)相關(guān)。
（2）DNMT3B與免疫缺陷
免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征(ICF綜合征)是第一個與先天性DNA甲基化缺陷相關(guān)的遺傳疾病(表1)。ICF的診斷通常包括染色體1、9和16的多放射狀染色體，與著絲粒周圍衛(wèi)星重復(fù)序列II和III的特異性低甲基化相關(guān)。DNMT3B基因的隱性突變定義了ICF1，占ICF病例的大多數(shù)。正如小鼠Dnmt3B功能缺失突變模型致死性所預(yù)期的，大多數(shù)ICF1突變導(dǎo)致單個氨基酸替換或缺失，被認為導(dǎo)致DNMT3B活性降低而非完全喪失。
ICF1患者特異性表現(xiàn)出生殖細胞系基因和X連鎖基因的CGI啟動子低甲基化，這與DNMT3B在小鼠發(fā)育過程中靶向這些序列一致，并表明這種靶向可能獨立于ZBTB14、CDCA7和LSH發(fā)生。相比之下，ICF2、ICF3和ICF4與ICF1的區(qū)別在于著絲粒α衛(wèi)星重復(fù)序列和神經(jīng)基因簇的低甲基化。這可能暗示ZBTB14、CDCA7和LSH在招募除DNMT3B外的其他DNMT到這些序列中的作用。
（3）DNMT3A、細胞生長和惡性腫瘤
雜合性、生殖細胞系DNMT3A突變與早產(chǎn)前生長障礙相關(guān)，具體表現(xiàn)取決于突變的性質(zhì)。錯義、獲得性功能突變在PWWP域中被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致微頭侏儒癥，這是一種表現(xiàn)為身體和頭部尺寸顯著但成比例減小的病理狀態(tài)。在小鼠中引入PWWP功能獲得性突變顯著再現(xiàn)了小頭畸形矮小癥的身體大小和腦重量減少以及異位甲基化表型。
相比之下，雜合性DNMT3A單倍體不足突變特征為Tatton-Brown–Rahman綜合征（TBRS，也稱為DNMT3A過度生長綜合征），表現(xiàn)為大頭畸形和輕度智力障礙(表1)。TRBS突變發(fā)生在DNMT3A基因各處，包括PWWP域(功能獲得性突變上游)、ADD域和MTase域。這些突變對DNA甲基化模式的影響尚未確定。
最后，體細胞DNMT3A突變與未成熟髓系細胞增殖增強和成人血液惡性腫瘤的發(fā)展相關(guān)。這些突變在約15-35%的急性髓系白血病(AML)病例中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)是MTase域中精氨酸882(R882)的錯義突變。
（4）TET2的DNA羥甲基化與癌癥
雖然體細胞DNMT3A活性喪失在AML中相當(dāng)常見，但TET2突變是血液惡性腫瘤更常見的原因，包括急性髓系白血�。ˋML）、慢性粒單核細胞白血病、淋巴瘤和骨髓增殖性腫瘤(表1)。TET2突變導(dǎo)致的5hmC含量降低，可能通過影響基因調(diào)控和其他細胞過程，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。
在DNMT3A突變癌細胞中，由于可用于TET2的5mC減少，5hmC也預(yù)期會減少。因此，5hmC修飾可能是惡性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)�，通過影響基因調(diào)控和/或通過招募5hmC reader的其他細胞過程。最近一項對Dnmt3A和Tet2雙突變小鼠的研究說明了這兩種酶之間的復(fù)雜上位性，涉及協(xié)同、競爭和獨立活動的組合。
體細胞SDH基因突變在胃腸道間質(zhì)瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細胞瘤)中發(fā)現(xiàn)，與富馬酸和琥珀酸的細胞內(nèi)水平升高、TET2活性抑制以及CGIs內(nèi)外的廣泛高甲基化相關(guān)，類似于IDH突變�？傊�，與DNA甲基化和去甲基化因子突變相關(guān)的疾病提供了對這些蛋白質(zhì)功能的細致理解。這些領(lǐng)域的持續(xù)研究有望為癌癥和遺傳疾病帶來治療突破。
四、結(jié)論與未來展望
盡管在理解DNA甲基化機制和模式方面取得了重大進展，但仍有許多未知之處。例如，為什么缺乏DNA甲基化的胚胎會在發(fā)育早期死亡？是由于編碼蛋白基因的異常表達、轉(zhuǎn)座元件的大規(guī)模去抑制、基因組不穩(wěn)定性，還是其他未知的原因？
隨著基因編輯技術(shù)、高靈敏度測序技術(shù)的發(fā)展，以及對DNA甲基化時序性動態(tài)變化的精確測量能力提升，許多傳統(tǒng)上難以解決的問題現(xiàn)在似乎可以得到初步答案，然而，挑戰(zhàn)依然存在，例如需要對特定細胞類型或發(fā)育階段的DNA甲基化模式進行序列特異性的定量分析，以了解在衰老和腫瘤發(fā)生過程中可能出現(xiàn)的不平衡。
未來的研究將繼續(xù)探索DNA甲基化的功能，特別是在早期胚胎和生殖細胞系中的廣泛去甲基化是否對多能性建立至關(guān)重要。此外，對非傳統(tǒng)模式生物的研究將繼續(xù)提供關(guān)于保守機制和功能的寶貴見解。
參考文獻：
Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):590-607. doi: 10.1038/s41580-019-0159-6.
本文深入剖析了DNA甲基化在哺乳動物發(fā)育與疾病中的多重角色，為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域提供了前沿且全面的視角。不僅闡釋了DNA甲基化在基因調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件沉默及基因組穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用，還揭示了其在胚胎發(fā)育、生殖細胞系分化等過程中的時序性變化與復(fù)雜機制力。此外，對表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病關(guān)系（包括理解衰老的發(fā)生機制）的解讀，為臨床診斷與治療提供了理論基礎(chǔ)。
一、DNA甲基化的細胞功能
（1）甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶" writers "與去甲基化酶" erasers "
DNA甲基化過程分為de novo甲基化（建立）、維持和去甲基化三個階段。
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶“writers”
DNMT3A和DNMT3B：兩種主要的de novo DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMTs），其包含高度保守的DNMT域（MTase domain）和兩個染色質(zhì)read域：ATRX-DNMT3-DNMT3L（ADD）和PWWP域(圖1a,b；表1)。ADD域可與H3K4me3結(jié)合，其與H3K4的甲基化程度呈負相關(guān)，當(dāng)H3K4未甲基化時，ADD域釋放MTase域的自抑制，從而允許DNA甲基化發(fā)生；PWWP域能與H3K36me3結(jié)合，這表明轉(zhuǎn)錄與基因體（gene body）的DNA甲基化之間存在機制聯(lián)系。
DNMT3L：是一種無催化活性的DNMT，它與DNMT3A和DNMT3B相互作用并特異性地在生殖細胞系中刺激它們的活性。
DNMT1：是維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其活性依賴于UHRF1蛋白。UHRF1通過其SRA域特異性結(jié)合復(fù)制叉上的半甲基化CpG二核苷酸，還通過TTD-PHD域結(jié)合H3K9me2和H3K9me3。UHRF1通過其UBL域招募DNMT1，釋放其自抑制狀態(tài)，使DNMT1能夠結(jié)合RFTS并甲基化子代DNA鏈。
DNA去甲基化酶" erasers "
TET蛋白（TET methylcytosine dioxygenases）：是主動DNA去甲基化的執(zhí)行蛋白，其逐步將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），這些氧化產(chǎn)物都能在復(fù)制過程中促進DNA去甲基化，5fC和5caC還可以通過TDG介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路發(fā)生去甲基化。
圖1：DNA甲基化的分子機制與作用過程。
a.啟動子區(qū)域的DNA甲基化機制。左圖：H3K4me3是活性或待激活啟動子的標(biāo)志，其阻止DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A/3B（DNMT3A/3B）及DNMT3L的ADD域與染色質(zhì)結(jié)合，從而迫使ADD與甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）域結(jié)合，抑制DNMT3酶活性。右圖：當(dāng)H3K4未甲基化時，ADD域與H3K4結(jié)合，解除DNMT3的自抑制狀態(tài)，使MTase域能夠催化DNA甲基化。b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制�；钴S轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過其SRA域（識別半甲基化CpG位點）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點的對稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點會阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；傅刃纬蓮�(fù)合物，促進基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
圖1：DNA甲基化的分子機制與作用過程。
a.啟動子區(qū)域的DNA甲基化機制。左圖：H3K4me3是活性或待激活啟動子的標(biāo)志，其阻止DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A/3B（DNMT3A/3B）及DNMT3L的ADD域與染色質(zhì)結(jié)合，從而迫使ADD與甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）域結(jié)合，抑制DNMT3酶活性。右圖：當(dāng)H3K4未甲基化時，ADD域與H3K4結(jié)合，解除DNMT3的自抑制狀態(tài)，使MTase域能夠催化DNA甲基化。b.基因體區(qū)域的DNA甲基化。在基因體中，ADD域通過結(jié)合未甲基化的H3K4釋放DNMT3的自抑制。活躍轉(zhuǎn)錄基因的基因體內(nèi)富含H3K36me3修飾，該修飾通過DNMT3的PWWP域招募甲基化酶，促進基因體甲基化。
c.DNA甲基化的維持機制。左圖：E3泛素連接酶UHRF1通過其SRA域（識別半甲基化CpG位點）和TTD域（結(jié)合H3K9me2）被招募至復(fù)制中的DNA。UHRF1的RING域泛素化修飾組蛋白H3尾部（Ub）。DNMT1的復(fù)制焦點靶向序列（RFTS）折疊至MTase域，抑制其催化活性。UHRF1通過其泛素樣（UBL）域與DNMT1的RFTS互作，招募DNMT1。右圖：當(dāng)RFTS結(jié)合泛素化H3尾部時，DNMT1的自抑制解除，從而維持CpG位點的對稱性甲基化。
（2）DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制
DNA甲基化與基因沉默之間的相關(guān)性隨著啟動子區(qū)域CpG二核苷酸密度的增加而增強，但DNA甲基化本身并不直接導(dǎo)致沉默，它可能通過以下幾種方式抑制轉(zhuǎn)錄：
阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合：某些轉(zhuǎn)錄因子對CpG甲基化敏感，甲基化的CpG位點會阻止這些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄激活。例如，研究發(fā)現(xiàn)22%的人類轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合甲基化的DNA時親和力降低。
招募染色質(zhì)重塑和修飾因子：DNMT蛋白可以與染色質(zhì)重塑因子和修飾因子相互作用，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致基因沉默。例如，DNMTs與淋巴細胞特異性螺旋酶（LSH）、H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；傅刃纬蓮�(fù)合物，促進基因沉默。
與MBD蛋白互作：哺乳動物有五種MBD蛋白（MBD1-MBD4和MeCP2），它們與核小體重塑和組蛋白去乙�；笍�(fù)合物相互作用，導(dǎo)致基因沉默。其中，除了MBD3外，其他MBD蛋白對CpG甲基化的結(jié)合能力隨CpG甲基化程度的增加而增加。
表1：DNA甲基化和去甲基化因子及其功能
（3）CpG島啟動子(CpG-island promoters)
CpG島（CGIs）是哺乳動物基因組中相對較短的基因組區(qū)域，平均約1kb，其CpG含量較高，超過三分之二的哺乳動物啟動子是CGIs，幾乎所有管家基因和一些發(fā)育調(diào)控基因都有CGI啟動子。CGIs通常很少發(fā)生甲基化，尤其是在分裂的雄性生殖細胞系中，它們未被CpG侵蝕，保留了較高的CpG含量。
X-chromosome inactivation（X染色體失活）：在雌性哺乳動物中，每個細胞中的一條X染色體會被隨機沉默，這一過程由非編碼RNA X- inactive specific transcript（XIST）在順式（in cis）中發(fā)揮作用。在X染色體失活過程中，DNA甲基化出現(xiàn)在相對較晚的階段，作為基因沉默后的最終鎖定機制。在小鼠中，X連鎖CGI啟動子的沉默主要依賴于DNMT3B，而SMCHD1在部分X連鎖CGI中也發(fā)揮重要作用，但其在人類中與DNA甲基化的聯(lián)系尚未明確。
Genomic imprinting（基因組印記）：基因組印記是指在兩個親本生殖細胞系中差異性地建立DNA甲基化模式，這些印記模式能夠抵抗早期胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的重編程。在小鼠和人類中，大約有20個基因組印記調(diào)控區(qū)域（ICRs）能夠抵抗這種重編程，從而強制相鄰基因單等位表達。ICRs大多在卵子中被甲基化，且都與極富CpG的CGIs重合，而三個父本ICRs則位于CpG貧乏的基因間序列中。在卵母細胞生長過程中，DNMT3A在DNMT3L的輔助下以轉(zhuǎn)錄依賴性方式甲基化卵母細胞表達基因的基因體，包括其內(nèi)含的CGIs（圖2b），而基因組的其余部分則保持低甲基化狀態(tài)。哺乳動物卵母細胞轉(zhuǎn)錄通常從位于典型CGI啟動子上游的替代啟動子發(fā)出，這些啟動子通常與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件序列重合。
母本(也包括父本)ICRs與其他在配子中被甲基化的序列區(qū)別在于它們富含特定的遺傳motif(TGCCGC)，這些motif在發(fā)生甲基化時會被KRAB鋅指蛋白57(ZFP57)識別。ZFP57招募KRAB相關(guān)蛋白1(KAP1，也稱為TIF1β)和其他沉默因子，包括DNMTs�？傊�，母本印記CGI能夠發(fā)生DNA甲基化，依賴于卵母細胞的特異性轉(zhuǎn)錄譜和特定的遺傳序列的共同作用。
Germline-specific genes（生殖細胞系特異性基因）：CGI啟動子的生殖細胞系特異性基因通過DNMT3B介導(dǎo)的DNA甲基化在胚胎植入后隨著體細胞分化開始被沉默。與大多數(shù)未甲基化的CpG富集啟動子不同，生殖細胞系CGIs進化出了序列特異性地招募DNA甲基化機制以確保終體細胞沉默的方式(圖2c)。
圖2：CGI啟動子的DNA甲基化靶向機制
a.X染色體失活中SMCHD1依賴的CGI de novo甲基化。SMCHD1形成同源二聚體，可能通過凝聚失活X染色體的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。在部分CGI區(qū)域，SMCHD1通過未知機制介導(dǎo)DNMT3B催化的DNA甲基化。b.母源印記的建立。在生長中的卵母細胞中，DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄延伸過程密切相關(guān)，依賴DNMT3A-DNMT3L復(fù)合體。小鼠受精后，印記啟動子通過結(jié)合鋅指蛋白57（ZFP57）-KRAB相關(guān)蛋白1（KAP1）復(fù)合體上的甲基化TGCCGC motif，抵抗早期胚胎的整體去甲基化。該復(fù)合體招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1及維持甲基化因子DNMT1和UHRF1，從而維持基因沉默。
c.生殖細胞系基因CGI啟動子的甲基化模型。部分生殖細胞系基因被非經(jīng)典多梳抑制復(fù)合體PRC1.6結(jié)合，該復(fù)合體包含L3MBTL2，可招募異二聚體H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9a-GLP。
（4）利用重復(fù)基因組
基因組防御轉(zhuǎn)座元件被認為是DNA甲基化進化的驅(qū)動力之一，哺乳動物基因組中DNA甲基化的主要靶標(biāo)不是基因而是轉(zhuǎn)座元件，尤其是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件。小鼠和人類基因組中有數(shù)百萬個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件拷貝，占據(jù)了大約一半的基因組空間。在小鼠Dnmt1敲除胚胎中，內(nèi)源性A粒子（IAP）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件被大量去抑制，導(dǎo)致嚴重的發(fā)育缺陷和胚胎致死(圖3a)。
DNMT3C是一種新發(fā)現(xiàn)的de novo DNMT，它在小鼠和大鼠的Muroidea譜系中通過串聯(lián)重復(fù)Dnmt3b基因起源。DNMT3C在雄性胎兒生殖細胞系中特異性表達，它選擇性地甲基化和抑制進化上年輕的轉(zhuǎn)座元件啟動子，這些轉(zhuǎn)座元件僅占小鼠基因組的1%。Dnmt3c突變小鼠表現(xiàn)出小睪丸和不育，其分子表型與生殖細胞系甲基化輔助因子Dnmt3l的突變體以及piRNA通路的突變體相同，piRNA通路是一類專門用于在生殖細胞系中沉默轉(zhuǎn)座元件的高度保守的小RNA。
除了短期內(nèi)抑制轉(zhuǎn)座元件表達外，DNA甲基化還通過脫氨基引起的突變促進它們的不可逆遺傳失活。此外，DNA甲基化可能通過限制非等位轉(zhuǎn)座元件拷貝之間的重組來維持基因組穩(wěn)定性，這一可能性得到了各種人類癌癥中DNA低甲基化與染色體重排（大多涉及轉(zhuǎn)座元件）之間正相關(guān)的支持。
圖3：基于DNA甲基化的轉(zhuǎn)座元件調(diào)控機制
b.piRNA介導(dǎo)的小鼠DNA甲基化模型。由轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)錄本生成的piRNA會裝載到MIWI2（即PIWIL4）上并定位至細胞核，通過未知機制招募DNMT3C-DNMT3L復(fù)合體。由于DNMT3C含有染色質(zhì)read的ADD域，可能存在一種機制（如通過賴氨酸去甲基化酶去除H3K4me3）來規(guī)避H3K4me3基因激活效應(yīng)。
c.小鼠胚胎干細胞（ESCs）中DNA甲基化缺失的補償機制。當(dāng)ESCs從高甲基化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至低甲基化培養(yǎng)基時，轉(zhuǎn)座元件可分為三類：H3K9甲基化未受干擾，但H3K27me3侵入轉(zhuǎn)座元件主體（A類）；H3K9甲基化保持不變（B類）；表觀沉默機制從H3K9甲基化切換為H3K27me3依賴性沉默（C類）。
d.UHRF1在半甲基化DNA中阻止SETDB1介導(dǎo)的IAP沉默。在條件性敲除Dnmt1的胚胎中，UHRF1持續(xù)結(jié)合復(fù)制后的半甲基化DNA，阻止H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1沉默IAP轉(zhuǎn)座元件。這一機制在野生型小鼠胎盤中具有生理意義：UHRF1結(jié)合半甲基化DNA導(dǎo)致IAP去抑制；而在Uhrf1突變的ESCs和胎盤中，SETDB1催化H3K9三甲基化，從而抑制IAP活性。
（5）基因體的謎團
基因體中DNA甲基化的富集提出了一個悖論：一方面，基因體甲基化在真核生物中高度保守，其保守程度甚至超過轉(zhuǎn)座元件；另一方面，DNA甲基化具有誘變性，那么為什么它在編碼序列中如此突出？重要的是，基因體DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，因此其作用與基因沉默無關(guān)。關(guān)于基因體中DNA甲基化功能的兩個假設(shè)被提出：一是促進轉(zhuǎn)錄延伸和/或共轉(zhuǎn)錄剪切，二是其抑制基因內(nèi)隱性啟動子。
轉(zhuǎn)錄延伸和剪切：DNA甲基化在基因體中的分布與外顯子富集有關(guān)，可能影響RNA聚合酶II（Pol II）的進程和剪切。例如，在人類CD45基因中，CCCTC結(jié)合因子（CTCF）減緩?fù)怙@子5處的RNA聚合酶II延伸速率，從而促進其包含；DNA甲基化則阻止CTCF結(jié)合，導(dǎo)致外顯子排除。相反，在其他位點，DNA甲基化可以通過招募MeCP2來促進外顯子包含，這與觀察到的替代外顯子平均甲基化水平低于組成性外顯子的事實一致。
抑制隱秘啟動子：這一假設(shè)與DNA甲基化作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能一致。如上所述，de novo DNA甲基化機制通過結(jié)合H3K36me3被招募到DNA上，而H3K36me3在釀酒酵母中已知可防止隱秘啟動子的使用。然而，基因體中的內(nèi)源性CGIs通常在小鼠和人類之間是保守的，其更可能是替代啟動子而非隱秘啟動子。最近的一項研究顯示，DNMT3B介導(dǎo)的基因體DNA甲基化限制了H3K36me3下游隱秘啟動子活性，但這種效應(yīng)在細胞群體中只在極小比例的細胞中觀察到。此外，Dnmt三敲除胚胎干細胞（ESCs）并未表現(xiàn)出與Dnmt3B單突變細胞相同的內(nèi)源性隱秘啟動子抑制。
二、發(fā)育中的甲基化模式
（1）早期胚胎和生殖細胞系
整體被動和主動去甲基化與局部de novo甲基化
生殖細胞系重編程過程中，DNA去甲基化伴隨著原始生殖細胞系(PGCs)獲得生殖細胞系特性的兩個階段。第一階段包括基因組大部分區(qū)域的被動去甲基化作為默認通路。隨后是TET1和TET2依賴性去甲基化，主要影響印記位點和生殖細胞系特異性基因(圖4a)，并與小鼠PGCs細胞核中5hmC的出現(xiàn)相吻合。
在受精后的重編程中，胚胎在向多能性發(fā)展過程中失去了從卵母細胞和精子遺傳的親本特異性DNA甲基化模式，這一過程也分為兩個階段。在小鼠單細胞期胚胎(受精卵)中，TET3介導(dǎo)的5hmC的出現(xiàn)和5mC的丟失同時發(fā)生，表明父本基因組最初通過TET3主動去甲基化；隨后兩個親本基因組經(jīng)歷幾輪被動的、DNA復(fù)制依賴性DNA甲基化稀釋，因為卵母細胞提供的維持酶DNMT1在隨后的細胞分裂中被排除在細胞核外(圖4a)。然而最近的全基因組亞硫酸鹽測序分析顯示，母本甲基化組在受精卵中也經(jīng)歷了有限的TET3依賴性氧化。其他研究還表明，大多數(shù)受精卵DNA甲基化的丟失與復(fù)制無關(guān)，在父本基因組中，這可能以TET3非依賴性方式通過未知機制發(fā)生。
單細胞全基因組亞硫酸鹽測序（scWGBS）揭示了人類胚胎基因組在進行整體去甲基化時普遍發(fā)生的de novo DNA甲基化：首先在單細胞階段的副本基因組中，然后在8細胞階段全基因組范圍內(nèi)發(fā)生，與胚胎基因組激活同時發(fā)生，主要靶向轉(zhuǎn)座元件。在小鼠發(fā)育過程中，一些de novo DNA甲基化也可能與胚胎或生殖細胞系基因組的整體去甲基化同時發(fā)生。
人類胚胎的DNA甲基化變化與小鼠相似，但也存在一些物種特異性差異。人類胚胎的初始快速去甲基化主要影響父本基因組，但發(fā)生在受精到2細胞階段，而小鼠則在單細胞階段完成。隨后，人類胚胎的全基因組DNA甲基化逐漸丟失，直到囊胚階段，但與小鼠相比，人類母本基因組在囊胚階段保留了更高的DNA甲基化水平。
圖4：發(fā)育過程中的DNA甲基化重編程
a.胚胎與生殖細胞系DNA甲基化的去除與重建。甲基胞嘧啶雙加氧酶TET3在受精卵中激活，催化羥甲基化并介導(dǎo)主動DNA去甲基化。隨后通過被動去甲基化（虛線表示），DNA甲基化水平在囊胚階段降至最低；囊胚植入后，由DNMT3A和DNMT3B介導(dǎo)的de novo甲基化重新建立甲基化模式。DNMT3L在此階段雖表達，但對胚胎基因組甲基化非絕對必需。在胚胎外組織中，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L表達量低于胚胎本體，導(dǎo)致相對低甲基化狀態(tài)。植入后，外胚層中部分干細胞分化為生殖細胞系細胞，經(jīng)歷兩波去甲基化：被動去甲基化及TET1/TET2介導(dǎo)的主動去甲基化。雄配子在出生前通過DNMT3A和DNMT3L（小鼠等嚙齒類還需DNMT3C）實現(xiàn)高甲基化；雌配子在減數(shù)分裂后、排卵前通過DNMT3A和DNMT3L（人類可能僅需DNMT3A）完成甲基化。b.Zdbf2位點的瞬時印記。植入前發(fā)育中，Zdbf2的長轉(zhuǎn)錄本（Liz）呈現(xiàn)印記狀態(tài)：母源等位基因甲基化沉默，父源等位基因未甲基化且表達。兩等位基因的啟動子均通過Polycomb介導(dǎo)的H3K27me3沉默。植入后，父源Liz的表達誘導(dǎo)其啟動子上游區(qū)域甲基化并驅(qū)逐H3K27me3，而母源等位基因仍受H3K27me3抑制。盡管Liz的印記短暫，但父源位點植入后的甲基化通過拮抗Polycomb抑制，實現(xiàn)Zdbf2的終身印記表達。若胚胎中Zdbf2激活失敗，將導(dǎo)致出生后生長缺陷。
c.組織特異性增強子的甲基化變化。體細胞中，調(diào)控元件的DNA甲基化呈現(xiàn)時序性變化。TET酶與轉(zhuǎn)錄因子（TF）協(xié)作介導(dǎo)去甲基化并激活增強子；而失活的增強子因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合減少，更易被de novo甲基化酶靶向。
d.神經(jīng)元中CpA甲基化的作用。出生后，DNMT3A在基因體沉積甲基化。甲基化的CAC序列（mCAC）被MeCP2識別，其結(jié)合可建立基因沉默的終身表觀遺傳記憶。
甲基化重編程及其抵抗的生物學(xué)意義
盡管胚胎和生殖細胞系去甲基化是全局性，但在兩個過程結(jié)束時，仍有相當(dāng)一部分DNA甲基化得以保留。這一現(xiàn)象引發(fā)了關(guān)于代際表觀遺傳繼承甚至跨代表觀遺傳繼承的可能猜想。
在植入前胚胎的內(nèi)細胞團中，小鼠和人類中約20%的CpGs保留了配子遺傳的甲基化(圖4a)。這些位點顯著定位到ICRs，與通過KRAB-ZFP招募KAP1的序列特異性DNA去甲基化抵抗有關(guān)。然而，ICRs在基因組中所占比例微不足道。除了這些經(jīng)典的ICRs外，還有數(shù)百個"瞬時"甲基化印記：這些主要從卵母細胞遺傳，通過類似于經(jīng)典ICRs的KRAB-ZFP依賴性保護，保持母系特異性DNA甲基化直到囊胚階段，并在植入后通過DNA甲基化或再甲基化丟失。這種現(xiàn)象在人類中可能尤為普遍，人類母本基因組在植入前以及植入后（僅在胎盤組織中）保留了比父本基因組更高的DNA甲基化水平。對Zdbf2位點的研究表明，父本等位基因的短暫低甲基化可以通過一系列下游表觀遺傳變化引起長期的印記，從而影響出生后大小。
在囊胚階段，基因組中抵抗重編程的大部分殘余配子甲基化與單拷貝序列無關(guān)，而是與轉(zhuǎn)座元件有關(guān)。在小鼠中，年輕的IAP類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件對植入前甲基化特別抵抗。在人類囊胚中，進化上年輕的、可能活躍的轉(zhuǎn)座元件，特別是靈長類動物特有的SINE-VNTR-Alu元件，保留了最高的DNA甲基化水平。DNA甲基化通過KRAB-ZFP介導(dǎo)的KAP1序列特異性招募保留，類似于KAP1在ICRs中的選擇性DNA結(jié)合。KRAB-ZFPs需要時間來發(fā)展對最近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座元件的匹配，因此最新的IAP元件(通常在小鼠品系之間多態(tài))在植入前發(fā)育過程中不能抵抗DNA甲基化重編程。
與植入前發(fā)育相比，生殖細胞系去甲基化更為廣泛。到小鼠胚胎發(fā)生的第13.5天，PGCs的CpGs甲基化水平僅為6%-8% (圖4a)。人類胎兒生殖細胞系在懷孕9周后也保留了類似的基線水平。與胚胎發(fā)育相反，ICRs在發(fā)育中的PGCs中進行甲基化，作為隨后在雄性和雌性生殖細胞系分化過程中獲得性別特異性DNA甲基化模式的先決條件。與植入前發(fā)育中的甲基化重編程類似，生殖細胞系DNA甲基化的保留主要在年輕且潛在有害的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件中觀察到。
（2）De novo DNA甲基化程序
在PGCs中重編程后，雄性和雌性生殖細胞系中建立了性別特異性的DNA甲基化模式。在配子發(fā)生結(jié)束時，精子基因組表現(xiàn)出約80%的CpG甲基化，而卵子基因組僅約50%被甲基化，且?guī)缀踔辉诨蝮w中(圖4a)。卵母細胞的相對低甲基化與DNMT1在細胞質(zhì)中的保留有關(guān)，這是由于STELLA蛋白將UHRF1隔離在細胞質(zhì)中的次級效應(yīng)。在Stella突變卵母細胞中，DNMT1進入細胞核，導(dǎo)致異位DNA甲基化沉積，DNA甲基化增加兩倍，導(dǎo)致雌性不育。這表明DNMT1在卵母細胞中能夠進行de novo DNA甲基化，而在胚胎細胞中則不然。
在胚胎重編程結(jié)束時(小鼠胚胎第4.5天)，囊胚由內(nèi)細胞團(將形成外胚層然后形成胚胎組織)和滋養(yǎng)外胚層及原始內(nèi)胚層組成。兩項全基因組分析研究證實，與外胚層相比，胚外外胚層(ExE)和內(nèi)臟內(nèi)胚層都是低甲基化的(圖4a)。DNA低甲基化在主要由ExE細胞分化而來的胎盤組織中持續(xù)存在。低甲基化與與外胚層相比DNMT3表達減少相關(guān)，甚至逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件也相對低甲基化。相比之下，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層中甲基化但外胚層中未甲基化的一組特定CGI啟動子。其甲基化增加要么反映了在胚外組織中需要保持被抑制，要么表明胚胎組織有更嚴格的機制來防止異常的DNA甲基化和長期沉默。
大腦在體細胞組織中表現(xiàn)出特殊的甲基化組。在小鼠和人類中，出生后CpA甲基化激增，由DNMT3A產(chǎn)生。神經(jīng)組織中總CpA甲基化水平與CpG甲基化大致相當(dāng)，mCpA頻率低于mCpG。MBD蛋白MeCP2結(jié)合年輕小鼠神經(jīng)元基因體中的mCAC序列，MeCP2的結(jié)合在生命后期保持這些基因的沉默(圖4d)。這一機制可以幫助理解DNA甲基化，特別是非CpG甲基化在調(diào)節(jié)神經(jīng)和行為特征中的作用。
三、表觀遺傳基因突變與復(fù)雜疾病的關(guān)系
（1）DNMT1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
DNMT1的雜合突變與一系列常染色體顯性遺傳的進行性認知和行為退化疾病有關(guān)，包括伴有癡呆和聽力損失的遺傳性感覺自主神經(jīng)病1E(HSAN1E)和伴有耳聾和發(fā)作性睡病的常染色體顯性小腦共濟失調(diào)(ADAC-DN)(表1)。
所有DNMT1突變都發(fā)生在RFTS域，導(dǎo)致DNA甲基化模式的輕微變化。對HSAN1E或ADAC-DN個體外周血的全基因組分析結(jié)果顯示主要表現(xiàn)為基因間區(qū)域的低甲基化和一些CGIs的高甲基化。這些DNA甲基化特征可作為可獲取細胞類型中的病理生物標(biāo)志物，但其不一定與疾病的大腦特異性表現(xiàn)相關(guān)。
（2）DNMT3B與免疫缺陷
免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征(ICF綜合征)是第一個與先天性DNA甲基化缺陷相關(guān)的遺傳疾病(表1)。ICF的診斷通常包括染色體1、9和16的多放射狀染色體，與著絲粒周圍衛(wèi)星重復(fù)序列II和III的特異性低甲基化相關(guān)。DNMT3B基因的隱性突變定義了ICF1，占ICF病例的大多數(shù)。正如小鼠Dnmt3B功能缺失突變模型致死性所預(yù)期的，大多數(shù)ICF1突變導(dǎo)致單個氨基酸替換或缺失，被認為導(dǎo)致DNMT3B活性降低而非完全喪失。
ICF1患者特異性表現(xiàn)出生殖細胞系基因和X連鎖基因的CGI啟動子低甲基化，這與DNMT3B在小鼠發(fā)育過程中靶向這些序列一致，并表明這種靶向可能獨立于ZBTB14、CDCA7和LSH發(fā)生。相比之下，ICF2、ICF3和ICF4與ICF1的區(qū)別在于著絲粒α衛(wèi)星重復(fù)序列和神經(jīng)基因簇的低甲基化。這可能暗示ZBTB14、CDCA7和LSH在招募除DNMT3B外的其他DNMT到這些序列中的作用。
（3）DNMT3A、細胞生長和惡性腫瘤
雜合性、生殖細胞系DNMT3A突變與早產(chǎn)前生長障礙相關(guān)，具體表現(xiàn)取決于突變的性質(zhì)。錯義、獲得性功能突變在PWWP域中被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致微頭侏儒癥，這是一種表現(xiàn)為身體和頭部尺寸顯著但成比例減小的病理狀態(tài)。在小鼠中引入PWWP功能獲得性突變顯著再現(xiàn)了小頭畸形矮小癥的身體大小和腦重量減少以及異位甲基化表型。
相比之下，雜合性DNMT3A單倍體不足突變特征為Tatton-Brown–Rahman綜合征（TBRS，也稱為DNMT3A過度生長綜合征），表現(xiàn)為大頭畸形和輕度智力障礙(表1)。TRBS突變發(fā)生在DNMT3A基因各處，包括PWWP域(功能獲得性突變上游)、ADD域和MTase域。這些突變對DNA甲基化模式的影響尚未確定。
最后，體細胞DNMT3A突變與未成熟髓系細胞增殖增強和成人血液惡性腫瘤的發(fā)展相關(guān)。這些突變在約15-35%的急性髓系白血病(AML)病例中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)是MTase域中精氨酸882(R882)的錯義突變。
（4）TET2的DNA羥甲基化與癌癥
雖然體細胞DNMT3A活性喪失在AML中相當(dāng)常見，但TET2突變是血液惡性腫瘤更常見的原因，包括急性髓系白血�。ˋML）、慢性粒單核細胞白血病、淋巴瘤和骨髓增殖性腫瘤(表1)。TET2突變導(dǎo)致的5hmC含量降低，可能通過影響基因調(diào)控和其他細胞過程，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。
在DNMT3A突變癌細胞中，由于可用于TET2的5mC減少，5hmC也預(yù)期會減少。因此，5hmC修飾可能是惡性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)�，通過影響基因調(diào)控和/或通過招募5hmC reader的其他細胞過程。最近一項對Dnmt3A和Tet2雙突變小鼠的研究說明了這兩種酶之間的復(fù)雜上位性，涉及協(xié)同、競爭和獨立活動的組合。
體細胞SDH基因突變在胃腸道間質(zhì)瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細胞瘤)中發(fā)現(xiàn)，與富馬酸和琥珀酸的細胞內(nèi)水平升高、TET2活性抑制以及CGIs內(nèi)外的廣泛高甲基化相關(guān)，類似于IDH突變�？傊�，與DNA甲基化和去甲基化因子突變相關(guān)的疾病提供了對這些蛋白質(zhì)功能的細致理解。這些領(lǐng)域的持續(xù)研究有望為癌癥和遺傳疾病帶來治療突破。
四、結(jié)論與未來展望
盡管在理解DNA甲基化機制和模式方面取得了重大進展，但仍有許多未知之處。例如，為什么缺乏DNA甲基化的胚胎會在發(fā)育早期死亡？是由于編碼蛋白基因的異常表達、轉(zhuǎn)座元件的大規(guī)模去抑制、基因組不穩(wěn)定性，還是其他未知的原因？
隨著基因編輯技術(shù)、高靈敏度測序技術(shù)的發(fā)展，以及對DNA甲基化時序性動態(tài)變化的精確測量能力提升，許多傳統(tǒng)上難以解決的問題現(xiàn)在似乎可以得到初步答案，然而，挑戰(zhàn)依然存在，例如需要對特定細胞類型或發(fā)育階段的DNA甲基化模式進行序列特異性的定量分析，以了解在衰老和腫瘤發(fā)生過程中可能出現(xiàn)的不平衡。
未來的研究將繼續(xù)探索DNA甲基化的功能，特別是在早期胚胎和生殖細胞系中的廣泛去甲基化是否對多能性建立至關(guān)重要。此外，對非傳統(tǒng)模式生物的研究將繼續(xù)提供關(guān)于保守機制和功能的寶貴見解。
參考文獻：
Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):590-607. doi: 10.1038/s41580-019-0159-6.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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