類器官研究發(fā)展歷程、培養(yǎng)指南及其在藥物評估的應(yīng)用前景

 FDA 宣布將在臨床前安全性研究中減少動物試驗，該方案于 4 月 10 日已開始應(yīng)用于臨床試驗新藥 (IND) 申請.....

2025 年 4 月 10 日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）宣布：計劃逐步取消單克隆抗體及其他藥物的動物實驗要求。

不用實驗動物？那用啥呢？

哎嘿，人家給的也很明確：使用包括 AI 計算模型、人類細(xì)胞系、類器官以及器官芯片系統(tǒng)等所謂的“新方法論”或 NAMs 數(shù)據(jù)替代動物實驗。

圖 1. 圖片來源于 FDA 官網(wǎng)新聞公告截圖。

這不，大佬發(fā)言了。



FDA 局長
Martin A. Makary 醫(yī)學(xué)博士

“通過利用基于人工智能的計算模型、基于人體器官模型的實驗室測試以及真實世界的人體數(shù)據(jù)，我們可以更快、更可靠地為患者提供更安全的治療，同時降低研發(fā)成本和藥品價格。這對公共衛(wèi)生和倫理道德而言是雙贏的。”

其實，美國早在2022年9月就正式通過了《FDA現(xiàn)代化法案2.0》《FDA Modernization Act 2.0》，該法案廢除了先前要求新藥在人體臨床試驗前必須進(jìn)行強(qiáng)制性動物測試的規(guī)定，從而允許在新藥的臨床試驗申請（IND）中使用人工智能模型、類器官芯片等非動物方法作為替代方案。

不過此番 FDA 更加堅定了自己前進(jìn)的步伐！同時發(fā)布的還有一份《減少臨床前安全性研究中動物實驗的路線圖》，該路線圖概述了FDA通過科學(xué)驗證的新方法（NAM）——例如器官芯片系統(tǒng)、計算建模和先進(jìn)的體外檢測——減少臨床前安全性研究中動物試驗，以及通過多機(jī)構(gòu)聯(lián)合 blablabla......具有重要意義。

就在FDA 宣布將逐步取消單克隆抗體和其他藥物的動物試驗要求后，支持與反對的聲音，額.....都有，都有。
 

更重要的是，2022 年 8 月，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)了全球首個基于“器官芯片”研究獲得臨床前數(shù)據(jù)的新藥（NCT04658472）進(jìn)入臨床試驗。

官方認(rèn)證了啊友友們！

于是，敏銳的各大企業(yè)紛紛開始大力投資和探索人體類器官、器官芯片及 AI 模擬試驗等新模式。MCE 也緊追其上，攜手上海交通大學(xué)藥學(xué)院簽署戰(zhàn)略合作協(xié)議，圍繞“AI+類器官+藥物研發(fā)”開展深度合作，共建國家級智能類器官藥物研發(fā)戰(zhàn)略平臺。

Section.01
人體“類器官”

人體“類器官”
類器官的首次提出：1997年。

但直到 2009 年，才出現(xiàn)第一個“完全”意義上的類器官模型——由荷蘭癌癥中心 (NKI) 的 Hans Clevers 團(tuán)隊培育的人造腸類器官 (Intestinal Organoid)，類器官研究取得重大突破。再到 2011 年，該團(tuán)隊又進(jìn)一步成功地利用結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織構(gòu)建了結(jié)直腸癌類器官模型，首次將類器官模型拓展至腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域，目前患者來源的類器官 (Patient-derived organoid，PDO) 模型在腫瘤領(lǐng)域研究十分火熱。在 2019 年，類器官登上了全球頂級學(xué)術(shù)期刊 Science 的封面，被評選為年度重大突破 (圖 2)^[1]

圖 2. 類器官研究的發(fā)展歷程^[1]。

類器官是模擬天然組織結(jié)構(gòu)和功能的自組織細(xì)胞培養(yǎng)物（例如肝臟類器官、腸道類器官），可以由成體組織中的干細(xì)胞或多能干細(xì)胞生成。作為傳統(tǒng)二維培養(yǎng)和動物模型之間的橋梁，具有諸多優(yōu)勢，既能提供實驗可操作性，又能捕捉生物的復(fù)雜性 (如下表 所示)^[2]。

類器官培養(yǎng)與二維細(xì)胞培養(yǎng)及動物研究的比較^[2]。

通常來講，人類類器官可從正�；驉盒栽�代組織中生成，最常用的方法是 R-spondin 方法，該方法是生成小腸類器官的基本設(shè)計原則�；蛘�，體細(xì)胞可以重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，通過定向分化，可用作所有三個胚層的類器官來源^[2]。

目前，類器官技術(shù)已與基因組編輯、單細(xì)胞基因組學(xué)、活體成像和微流體技術(shù)等技術(shù)良好地融合，應(yīng)用于疾病建模、篩選抗癌藥物、識別藥物毒性、基因測試和細(xì)胞療法等諸多領(lǐng)域。不僅為發(fā)育過程和疾病發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，也加速了疾病診斷和治療方法的研究進(jìn)程。

關(guān)于類器官的模型構(gòu)建小 M 在往期推文已進(jìn)行過實操案例的解讀，此處不在贅述。但是！類器官的實操也要多多留心，科研人表示：翻車的代價，莫要挨邊！

類器官培養(yǎng)指南
樣本：選擇、保存、清洗^[3][4]

• 組織來源：新鮮樣本 (手術(shù)或活檢)＞凍存組織，但若必須凍存，記得使用凍存液 (別讓細(xì)胞變成“冰棍”)。
• 運輸介質(zhì)：用專用的試劑保存組織細(xì)胞的活性，避免樣本在運輸途中壞死。
• 保存時間：4℃ 保存不超過 24 h，-80℃ 或液氮長期保存 (但復(fù)蘇后活性可能打折扣)。
• 培養(yǎng)基/PBS 沖洗：去除血液、粘液和碎片，否則消化時會“一鍋糊”，建議冰上操作。
• 抗生素防污染：對于污染風(fēng)險比較高的樣本 (如腸道、腫瘤組織)，可加 1% P/S 殺菌。

 
組織消化

• 預(yù)處理：清洗干凈的樣本剪切成合適的大小準(zhǔn)備消化。
• 酶選擇：膠原酶 IV (溫和)、胰蛋白酶 (較強(qiáng)) 以及商品化的消化液都可以使用！ 
• 注意觀察：每 5 min 觀察一次組織的消化情況，避免消化過頭。
• 終止消化：使用無血清終止液，避免 FBS 未知成分干擾。

 
接種培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇

• 基質(zhì)膠：提前解凍，冰上操作 (室溫凝固)。
• 培養(yǎng)：選擇合理細(xì)胞密度 (可參考文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化) 培養(yǎng)，專用培養(yǎng)基提供生長、分化物質(zhì),類器官長滿或成熟后,進(jìn)行分離、消化、傳代——輕柔吹打或短暫消化傳代。
• 凍存：傳代 2~3 次的類器官活力佳，凍存密度＞ 2×10⁵/mL。
• 復(fù)蘇要快：37℃ 水浴快速融化，慢吞吞？細(xì)胞會“凍傷”。

 
類器官檢測

• 細(xì)胞活性：在藥敏實驗中經(jīng)常會用到 3D&類器官 ATP 和活力檢測試劑來進(jìn)行基礎(chǔ)活性判斷。
• 染色：DAPI 染核，標(biāo)志物特異性識別，多維度表型鑒定。MCE 最新開學(xué)季活3D 細(xì)胞培養(yǎng)類，專享 65 折！

Section.02 
器官芯片系統(tǒng)

器官芯片系統(tǒng)

言歸正傳！NCT04658472 是首個使用微生理系統(tǒng) (MPS，通過微流控技術(shù)實現(xiàn)多器官聯(lián)動) 數(shù)據(jù)提交的 IND，星星之火可以燎原，器官芯片賽道被“唰唰唰”點燃！

器官芯片(Organs-on-a-Chips，OOC) 是生物工程的小型化系統(tǒng)，內(nèi)有在微流體芯片內(nèi)生長的細(xì)胞/組織^[5]。從命名上就能看出其涉及多學(xué)科領(lǐng)域，生物學(xué)，材料學(xué)，工程學(xué)，blabla~~

其得益于微流體和各種設(shè)備 (例如微型顯微鏡、無透鏡顯微鏡) 和監(jiān)測系統(tǒng)，例如執(zhí)行器、傳感器和生物傳感器 (用于實時監(jiān)測細(xì)胞生長和活力以及維持健康和最佳的培養(yǎng)微環(huán)境) 的發(fā)展^[5]。

通常，OOC 由三個主要組成部分組成：(1) 模擬細(xì)胞可以附著、生長和相互作用的器官組織的微通道，(2) 在通道 (或孔) 中培養(yǎng)的活細(xì)胞，例如干細(xì)胞，以及 (3) 仿生環(huán)境，維持與器官相關(guān)的條件，例如營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣水平和液體流動^[5]。

各位友友們可以通過下圖簡單了解下~

圖 3. 無支架骨髓芯片橫截面示意圖的放大 3D 圖^[5]。
包括用于顯微鏡實時觀察的玻璃層和容納上部細(xì)胞培養(yǎng)微室的三個 PDMS 層，與下部培養(yǎng)基灌注分離，中間多孔膜。

相比類器官，器官芯片裝置則更進(jìn)一步，在生物工程芯片上整合了微流體、機(jī)械力和多細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)環(huán)境。例如，人體肝臟芯片可以在灌注條件下將肝細(xì)胞與非實質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，表現(xiàn)出類似肝臟的代謝和反應(yīng)。這些平臺保留了動物所缺乏的人類特異性生物學(xué)特性，從而能夠檢測僅在人體組織中表現(xiàn)出來的效應(yīng)。

當(dāng)然，OOC 的設(shè)計多種多樣。研究人員和工程師已經(jīng)設(shè)計和制造了具有精確結(jié)構(gòu)和專用微流體通道的微流體裝置。設(shè)計的選擇取決于支持細(xì)胞/組織生長和功能的培養(yǎng)需求。通常還會集成微泵和微閥等控制系統(tǒng)，用于控制通道內(nèi)的壓力和流體流動^[5]。

OOC 技術(shù)的優(yōu)點^[5]

01
OOC 技術(shù)減少并最終避免了動物試驗。平臺可以為人體模型重新創(chuàng)建高度可重復(fù)的環(huán)境，無需進(jìn)行動物試驗。它們可實現(xiàn)高通量篩選和測試，降低任務(wù)成本和時間，同時提高效率。

02
OOC 可用于個性化測試。現(xiàn)在可以通過將人自己的細(xì)胞集成到 OOC 設(shè)備中來重新創(chuàng)建微環(huán)境。這樣可以實時監(jiān)測各種藥物的反應(yīng)、有效性及其毒性，以及檢測各種生物標(biāo)志物。 

03
OOC 也可用于醫(yī)學(xué)測試。由于 OOC 平臺體積小且自動化，因此可用于床旁診斷，例如在醫(yī)院或移動診所，從而實現(xiàn)分散測試。

04
OOC 可以在同一芯片上集成多種檢測，并且可以同時執(zhí)行各種并行測試，而無需依賴復(fù)雜的儀器 (并行測試)。

05
此外，OOC 還可用于藥物遞送和毒性測試。各種人類疾病都可以在 OOC 和靶向藥物遞送系統(tǒng)上建模，可以通過使用各種運輸機(jī)制 (例如納米顆粒) 進(jìn)行評估，并在評估藥物的療效和毒性的同時重建類人細(xì)胞和生理屏障。

目前已有各種器官芯片技術(shù)，如：Brain-on-a-chip、Bone-on-a-chip、Kidney-on-a-chip、Lung-on-a-chip、Pancreas-on-a-chip、Heart-on-a-chip、Stomach-on-a-chip 等，以及開發(fā)的人體芯片 (Human-on-a-chip) ——涉及創(chuàng)建可刺激人體器官功能的微流體裝置^[5]。

人體芯片 (Human-on-a-chip)

人體芯片裝置的開發(fā)技術(shù)就比較復(fù)雜，其涉及將多器官(2 至 10 個器官) 整合到芯片上。例如，它需要復(fù)雜的微流體通道、龐大的裝置和精密的處理系統(tǒng) (如果實現(xiàn)自動化)。當(dāng)然，它們需要在多個腔室中培養(yǎng)可能來自不同器官的不同細(xì)胞類型，這些腔室通過循環(huán)培養(yǎng)基連接，以模擬血液循環(huán)系統(tǒng)并研究多器官的生理學(xué)^[4]。其不僅可以預(yù)測藥物對目標(biāo)器官的影響，還可以使用芯片體系統(tǒng)，深入了解藥物遞送對其他器官的副作用。

還記得前面提過的 NCT04658472 臨床試驗么？其前期的部分支持?jǐn)?shù)據(jù)就來自于人體芯片模型。

2022 年 4 月，John W Rumsey 等人在 Advanced Therapeutics 期刊發(fā)布題為“Classical Complement Pathway Inhibition in a “Human-On-A-Chip” Model of Autoimmune Demyelinating Neuropathies”的文獻(xiàn)^[6]。

圖 4. 一種新型體外人體芯片系統(tǒng)^[6]。
該系統(tǒng)由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 衍生的運動神經(jīng)元和人施萬細(xì)胞組成，這些細(xì)胞在微電極陣列 (MEA) 上培養(yǎng)，微電極陣列上裝有通道，用于引導(dǎo)軸突生長到電極上。作者用抗 GM1 多克隆 IgG 和純化的人補(bǔ)體蛋白處理該系統(tǒng)，以建立并表征 EAN 的首個 HoaC 疾病模型。隨后，用 MMN 和 CIDP 患者的血清處理該 HoaC 系統(tǒng)，建立了兩種罕見的外周脫髓鞘神經(jīng)病模型。最后，用 TNT005 (一種抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑關(guān)鍵蛋白酶 C1s 的鼠單克隆抗體 (mAb)）處理 MMN 和 CIDP 系統(tǒng)，以挽救疾病效應(yīng)。

研究首次構(gòu)建了用于研究獲得性炎性脫髓鞘性神經(jīng)病的運動神經(jīng)元傳導(dǎo)速度的罕見疾病——慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病 (CIDP) 和多灶性運動神經(jīng)病 (MMN)——的表型人體芯片 (HoaC) 電傳導(dǎo)模型。HoaC 模型使用微電極陣列，在用患者血清處理的電極上定向軸突生長，結(jié)果顯示運動神經(jīng)元動作電位頻率和傳導(dǎo)速度降低，TNT005 處理后挽救了血清誘導(dǎo)的補(bǔ)體沉積和功能缺陷^[6]。

該模型生成的數(shù)據(jù)為 NCT04658472 的臨床前試驗中測試 C1s 抑制效果提供了支持，并通過 FDA 批準(zhǔn)，進(jìn)入臨床試驗。

Section.03
先進(jìn)的計算機(jī)模擬

FDA 新發(fā)布的路線圖鼓勵開發(fā)者利用計算機(jī)建模和人工智能 (AI) 來預(yù)測藥物的行為^[7]。主要的計算機(jī)模擬工具包括：

• 基于生理學(xué)的藥代動力學(xué) (PBPK) 建模：PBPK 模型是利用物種特異性生理學(xué)對藥物 ADME (吸收、分布、代謝、排泄) 進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬。
• 機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能預(yù)測模型：機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以根據(jù)藥物序列特征、結(jié)構(gòu)基序和已知的臨床結(jié)果進(jìn)行訓(xùn)練。目前開發(fā)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型可以分析抗體可變區(qū)的氨基酸序列，以預(yù)測單克隆抗體可能具有高還是低的免疫原性。
• 定量系統(tǒng)藥理學(xué)(QSP) 和生物通路建模：QSP 模型結(jié)合了計算生物學(xué)和藥理學(xué)，模擬藥物如何與復(fù)雜的人體生物網(wǎng)絡(luò)相互作用。例如，自身免疫性疾病的 QSP 模型可以模擬抗體如何調(diào)節(jié)炎癥通路，從而有助于預(yù)測有效劑量范圍和潛在的毒性后果 (例如免疫系統(tǒng)過度抑制)。這些模型可以通過提供一個虛擬人體來測試“假設(shè)”情景，從而減少對動物疾病模型的依賴。
• 生物信息學(xué)和計算機(jī)模擬脫靶篩選：利用人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和人工智能，可以篩選產(chǎn)品序列中是否存在任何非預(yù)期靶點(例如與人體組織的交叉反應(yīng))。計算機(jī)模擬工具可以分析藥物是否可能與人體蛋白質(zhì)組中的相似表位結(jié)合，從而突出潛在的安全隱患，而這些隱患傳統(tǒng)上需要通過動物組織交叉反應(yīng)研究或廣泛的受體結(jié)合組來檢查。

 
總體而言，計算機(jī)模擬自然醫(yī)學(xué)模型 (NAM) 可以通過數(shù)據(jù)和建模預(yù)測與人類相關(guān)的結(jié)果，從而成為動物研究的有力補(bǔ)充或替代。

產(chǎn)品推薦

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人肺腺癌類器官培養(yǎng)試劑盒 (HY-K6102) 專為肺癌類器官定制，“一站式”搞定！

[1] XIAO Yi, et al. Research progress and future perspectives of tumor organoid[J]. China Oncology, 2024, 34(8): 763-776 
[2] Li M, et al. Organoids - Preclinical Models of Human Disease. N Engl J Med. 2019 Feb 7;380(6):569-579. 
[3] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5
[4] Jacob F, et al.A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity. Cell. 2020 Jan 9;180(1):188-204.e22.
[5] Obeid PJ, et al. Organ-On-A-Chip Devices: Technology Progress and Challenges. Chembiochem. 2024 Dec 2;25(23):e202400580. 
[6] Rumsey JW, et al. Classical Complement Pathway Inhibition in a "Human-On-A-Chip" Model of Autoimmune Demyelinating Neuropathies. Adv Ther (Weinh). 2022 Jun;5(6):2200030. 
[7] Roadmap to Reducing Animal Testing in Preclinical Safety Studies.