生物發(fā)光 vs 熒光成像，怎么選？

在設(shè)計(jì)和開(kāi)展動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)有兩種模式：生物發(fā)光和熒光成像。這兩套模式為什么要同時(shí)存在？它們究竟有何不同，各自又發(fā)揮著怎樣的作用？
要回答這些問(wèn)題，我們首先得弄明白：活體成像究竟是怎么成像的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，小動(dòng)物活體成像是通過(guò)某種方式讓研究對(duì)象具備“發(fā)光”的能力，再利用成像設(shè)備將這些光信號(hào)采集并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最終生成圖像。也就是說(shuō)，成像的前提是讓實(shí)驗(yàn)對(duì)象在體內(nèi)有一個(gè)可以被檢測(cè)到的光源，而目前常見(jiàn)的方式便是這兩種：生物發(fā)光和熒光。
 
 

生物發(fā)光成像的靈感來(lái)自自然界，螢火蟲(chóng)和深海魚(yú)在黑暗中自發(fā)光的能力長(zhǎng)期吸引著研究者。19世紀(jì)末，法國(guó)生物學(xué)家 Raphaël Dubois 提出了“熒光素（luciferin）/熒光素酶（luciferase）”的概念；而20世紀(jì)中期，William D. McElroy團(tuán)隊(duì)揭示了螢火蟲(chóng)發(fā)光的化學(xué)機(jī)制，確定這是一類(lèi)依賴(lài) ATP 的酶促反應(yīng)，并成功分離出關(guān)鍵發(fā)光酶，至此生物自發(fā)光的機(jī)制基本明確。其核心過(guò)程是：熒光素酶催化熒光素在 ATP 和氧氣作用下被氧化生成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物，隨后該產(chǎn)物回到基態(tài)時(shí)釋放光子，實(shí)現(xiàn)從化學(xué)能到光能的轉(zhuǎn)化。
1980年代，分子生物學(xué)將該體系用于基因研究：Ow 將熒光素酶基因?qū)�入植物，de Wet 應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，確立其為跨物種、高靈敏、可定量的報(bào)告基因；通過(guò)體內(nèi)注射底物即可“點(diǎn)亮”目標(biāo)細(xì)胞。
1990年代中期，這一體系首次用于活體成像。Christopher Contag團(tuán)隊(duì)利用細(xì)菌發(fā)光基因在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)非侵入成像；1997年，他們進(jìn)一步將螢火蟲(chóng)體系用于哺乳動(dòng)物，實(shí)現(xiàn)了活體基因表達(dá)可視化。這一突破使研究者能夠動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長(zhǎng)、基因表達(dá)及藥物作用，大幅拓展了生物醫(yī)學(xué)研究手段。
 

熒光成像的發(fā)展要從綠色熒光蛋白（GFP）說(shuō)起。1962年，下村修在維多利亞水母（Aequorea victoria）中分離出一種在紫外光下發(fā)出綠色熒光的蛋白，并逐步解析其化學(xué)特性。1992年，Prasher克隆了 GFP 基因；1994年，Chalfie將其導(dǎo)入大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲(chóng)，證明僅表達(dá)該基因即可在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光，而無(wú)需額外底物。隨后，Roger Tsien通過(guò)蛋白質(zhì)工程顯著提高了 GFP 的亮度和穩(wěn)定性，并拓展至多種顏色變體，奠定了多色熒光成像的基礎(chǔ)。三人也因這一系列貢獻(xiàn)于2008年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。其發(fā)光機(jī)制是：熒光分子吸收外部特定波長(zhǎng)的光子后，電子躍遷至激發(fā)態(tài)，隨后回到基態(tài)時(shí)釋放出能量較低的光子，即我們檢測(cè)到的熒光信號(hào)。
除基因標(biāo)記外，還開(kāi)發(fā)了多種小分子熒光染料（如 Cy5、Cy7、ICG 等），可與特定分子結(jié)合，經(jīng)外部光源激發(fā)實(shí)現(xiàn)成像。成像波段也擴(kuò)展至近紅外 NIR-I（650–900 nm）和 NIR-II（1000–1700 nm），以提高組織穿透和信噪比，支持更深部成像。
經(jīng)過(guò)前面的介紹可以看出，生物發(fā)光與熒光成像在原理和表現(xiàn)上差異顯著。
 

生物發(fā)光：依賴(lài)熒光素酶+底物的化學(xué)反應(yīng)，在體內(nèi)直接產(chǎn)生光子。無(wú)需外部光源，背景噪聲極低，信噪比高，尤其適合檢測(cè)低水平的基因表達(dá)或少量細(xì)胞變化。底物注射機(jī)制還能讓發(fā)光的時(shí)間和部位可控。
熒光成像：依賴(lài)外部光源激發(fā)，讓熒光分子電子躍遷并回到基態(tài)時(shí)釋放光子，信號(hào)亮度更高，能夠輕松實(shí)現(xiàn)多顏色、多靶點(diǎn)同步成像。
 
 

生物發(fā)光：
優(yōu)點(diǎn)：背景噪聲極低，信噪比高，非常適合檢測(cè)弱信號(hào)（如低水平基因表達(dá)、少量細(xì)胞變化）。發(fā)光時(shí)機(jī)和部位可控（通過(guò)底物注射調(diào)整）。
缺點(diǎn)：光子產(chǎn)量低，整體亮度不足�？臻g分辨率有限，多重成像能力較弱（通常單通道）。

熒光成像：
優(yōu)點(diǎn)：信號(hào)亮度高，圖像更清晰。多顏色、多靶點(diǎn)成像能力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)多通道同步觀察。近紅外波段拓展（NIR-I/NIR-II）提高組織穿透力和信噪比，支持深部成像。
缺點(diǎn)：背景自發(fā)熒光和散射干擾較大，需要良好的濾光與光路設(shè)計(jì)。對(duì)數(shù)據(jù)處理和校正要求高，避免假陽(yáng)性或偽影。
 
 

那么，面對(duì)具體實(shí)驗(yàn)，該如何選擇合適的成像模式呢？
 

什么時(shí)候優(yōu)先選擇生物發(fā)光成像？
①當(dāng)研究重點(diǎn)是疾病發(fā)展趨勢(shì)（如腫瘤生長(zhǎng)、炎癥擴(kuò)散、感染進(jìn)展）時(shí)。
②需要連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)時(shí)，生物發(fā)光無(wú)需外部光源，背景噪聲極低，便于多時(shí)間點(diǎn)跟蹤。
③在基因表達(dá)或細(xì)胞存活等低信號(hào)實(shí)驗(yàn)中，生物發(fā)光能提供穩(wěn)定、可量化的數(shù)據(jù)。
 
什么時(shí)候優(yōu)先選擇熒光成像？
①當(dāng)研究需要精確解剖定位，如描繪腫瘤邊界、顯示器官結(jié)構(gòu)時(shí)。
②需要多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)（如腫瘤、血管、免疫細(xì)胞等）時(shí)，熒光的多色探針可實(shí)現(xiàn)多通道成像。
③研究對(duì)象位于深部組織或是低表達(dá)分子時(shí)，近紅外熒光（NIR-I/NIR-II）能改善穿透和信噪比。
 
是否可以聯(lián)合使用兩種模式？
如果既需要整體動(dòng)態(tài)信息，又要精確空間定位，聯(lián)合使用生物發(fā)光和熒光成像可以獲得更全面的結(jié)果。若既需要整體動(dòng)態(tài)信息，又要精確空間定位，聯(lián)合使用兩種模式往往能獲得更全面的結(jié)果。

 
 

為了充分利用生物發(fā)光與熒光成像各自的優(yōu)勢(shì)，廣州光儀生物科技有限公司推出了LASER 系列多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，既能捕獲極微弱的生物發(fā)光信號(hào)，也可實(shí)現(xiàn)多通道熒光成像，滿(mǎn)足腫瘤、神經(jīng)科學(xué)、藥物分布等多領(lǐng)域研究需求。
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部分參考文獻(xiàn)：
[1]Ow DW, Wood KV, DeLuca M, et al. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science. 1986;234(4778):856-859. doi:10.1126/science.234.4778.856
[2]Contag CH, Spilman SD, Contag PR, et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochemistry and Photobiology. 1997;66(4):523-531. doi:10.1111/j.1751-1097.1997.tb03184.x
[3]Heim R, Cubitt AB, Tsien RY. Improved green fluorescence. Nature. 1995;373:663–664. doi:10.1038/373663b0