慢病毒的作用機(jī)制及制備In vivo CAR-T的核心原理

文章來(lái)源公眾號(hào)：生物快評(píng)         作者：生物快評(píng)

慢病毒原理背景

HIV病毒顆粒和基因組
HIV病毒是屬于envelope virus,這個(gè)envelope本意指的是信封上蓋的蠟戳，用于封閉信件的作用，這里指的是病毒粒子外面有一層磷脂雙分子脂質(zhì)層。就是上圖中的綠色部分，這樣的有點(diǎn)是病毒的例子完全被雙分子層的膜罩住了，那么暴露的抗原自然就少了。相對(duì)比non-envelope virus就需要病毒粒子直面宿主的免疫系統(tǒng)。

因?yàn)樵谒�溶液中，人體的環(huán)境下，膜和膜融合不是天然發(fā)生的事情，需要克服膜周邊水分子的排次作用，所以這樣也給病毒和宿主細(xì)胞膜融合帶來(lái)了另一個(gè)問(wèn)題就是“感染入侵的問(wèn)題”，這里需要進(jìn)化出一套精密的“分子機(jī)器”，來(lái)完成病毒的膜和宿主細(xì)胞膜的融合。這些融合的完成需要依靠“配體-受體”作用來(lái)完成。

DOI:10.1016/j.bbamem.2016.02.007

病毒的蛋白質(zhì)包括：
Gag: 這個(gè)gag是產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白,gag這個(gè)名稱(chēng)怎么來(lái)的？一般在病毒學(xué)研究中，研究者對(duì)基因的命名充滿(mǎn)了隨意和簡(jiǎn)單直接，不像對(duì)人基因的命名要信達(dá)雅，這個(gè)鬼畜的縮寫(xiě)是group of antigen,意思是這個(gè)病毒蛋白主要激發(fā)人體產(chǎn)生抗體的，所以叫做“一組抗原”。

gag蛋白質(zhì)產(chǎn)生MA/CA/NC。分別是MA: matrix蛋白，矩陣蛋白，結(jié)合包膜的作用，類(lèi)似房屋的頂部支撐，。CA：capsid蛋白，包裹病毒粒子的作用，類(lèi)似藥物的膠囊殼。NC: nucleocapsid protein，NC是負(fù)責(zé)包裹病毒的核酸物質(zhì)。最終通過(guò)

“俄羅斯套娃”一樣的結(jié)構(gòu)，得到封裝好的HIV病毒粒子。

pol: pol蛋白是產(chǎn)生病毒的酶相關(guān)的蛋白：包括PR: 蛋白酶，RT：逆轉(zhuǎn)錄酶；IN: 整合酶（負(fù)責(zé)將DNA整合進(jìn)入宿主基因組組）。

gp120和gp41，它們是一個(gè)復(fù)合體的兩個(gè)部分，共同被稱(chēng)為包膜糖蛋白，是HIV病毒入侵人體細(xì)胞的“鑰匙”，也是艾滋病藥物和疫苗研究最重要的靶點(diǎn)之一。gp120：是暴露在外的“鉤子”或“探頭”，負(fù)責(zé)識(shí)別和初步結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞。gp41：是隱藏的“彈簧刀”或“錨”，負(fù)責(zé)膜融合，即刺穿細(xì)胞膜，讓病毒核心進(jìn)入細(xì)胞。

Rev：Rev is a transactivating protein that is essential to the regulation ofHIV-1 (and other lentiviral) protein expression。負(fù)責(zé)完整RNA從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，完成病毒完整RNA和蛋白質(zhì)的組裝。

Tat: Trans-activator oftranscription（反式轉(zhuǎn)錄激活因子），大幅增強(qiáng)病毒基因的轉(zhuǎn)錄（將DNA模板轉(zhuǎn)化為RNA的過(guò)程），沒(méi)有Tat，HIV的復(fù)制效率會(huì)極低。

HIV的gp120/gp40包膜為VSV病毒的G蛋白

https://viralzone.expasy.org/5096

HIV病毒通過(guò)受體gp120結(jié)合受體CCR5、CD4之后，然后激動(dòng)觸發(fā)gp40暴露，gp40結(jié)構(gòu)發(fā)生變化將gp40的疏水端插入到細(xì)胞膜上，介導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜的融合。然后HIV capsid釋放到了細(xì)胞質(zhì)中，然后capsid經(jīng)過(guò)激動(dòng)蛋白結(jié)合并且在微管蛋白上運(yùn)動(dòng)，這樣capsid運(yùn)輸?shù)搅撕丝�，最后向核孔�?nèi)釋放出病毒粒子中的酶和核酸。隨后就發(fā)生了逆轉(zhuǎn)錄、整合等作用。

DOI 10.1074/jbc.M112.424432

HIV的gp160在病毒包裝過(guò)程中經(jīng)過(guò)宿主的蛋白酶水解得到gp120/gp41，兩者是通過(guò)二硫鍵形成二聚體，然后在形成三聚體。Gp120糖基化程度高，且突變多，相當(dāng)于亞穩(wěn)態(tài)的gp41埋藏在gp120中，當(dāng)gp120結(jié)合CD4\CCR5等分子后，gp41改變而結(jié)合細(xì)胞膜，最后膜融合，病毒進(jìn)入細(xì)胞。

Viruses 2024, 16(12), 1933; https://doi.org/10.3390/v16121933

再看VSV病毒通過(guò)G蛋白結(jié)合LDL-R，因?yàn)長(zhǎng)DL-R天然的作用是結(jié)合脂蛋白，結(jié)合之后LDL-R和脂蛋白一起通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白被內(nèi)吞，這樣細(xì)胞就完成了脂質(zhì)的攝入；VSV病毒的G蛋白就利用這個(gè)“運(yùn)輸?shù)暮箝T(mén)”，VSV的G蛋白結(jié)合LDL-R之后，細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入endosome，VSV病毒進(jìn)入到endosome中激發(fā)endosome中的質(zhì)子泵而endosome提高了H+濃度，即pH下降。Endosome進(jìn)一步轉(zhuǎn)為lysosome，因?yàn)閜H的下降，VSVG蛋白中一些組氨酸在pH中電荷改變導(dǎo)致VSVG結(jié)構(gòu)變化，然后VSVG的疏水端暴露出來(lái)結(jié)合到lysosome的膜上，類(lèi)似VSVG在lysosome中“撕開(kāi)”膜，VSV病毒粒子釋放到了細(xì)胞質(zhì)中，隨后VSV釋放遺傳物質(zhì)，隨后整個(gè)遺傳物質(zhì)復(fù)制、RNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，病毒組裝均在細(xì)胞質(zhì)中。

https://doi.org/10.1073/pnas.1618883114

目前慢病毒都將gp120/gp41復(fù)合物換成了VSV的病毒的包膜，那么這種改變其實(shí)除了改變HIV的靶向性，也改變了病毒的生命周期中的路徑。

我們利用VSV.G包裝的慢病毒通過(guò)逃逸endosome之后，慢病毒capsid依然比較完整，還可以接著依靠Dynein完成運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。設(shè)想一下，如果VSV.G的融合逃逸能力和融合速度不足夠，響應(yīng)pH下降的速度較慢，那么慢病毒的capsid則會(huì)在lysosome中無(wú)法快速逃逸，最終LV殼就會(huì)破壞而進(jìn)入不了細(xì)胞核。

第二代慢病毒和第三代慢病毒的區(qū)別

2nd vs 3rd Generation Lentiviral Systems

2nd vs 3rd Generation Lentiviral Systems
Feature	2nd Generation	3rd Generation
Transfer Plasmid	Can be packaged ONLY by a second generation packaging system that   includes TAT	Can be packaged by both 2nd and 3rd generation packaging systems
Packaging Plasmid	All on one plasmid: Gag, Pol, Rev, Tat	Two plasmids: one encoding Gag   and Pol and another   encoding Rev
Envelope Plasmid	Interchangeable: usually encodes for VSV-G	Interchangeable: usually encodes for VSV-G
Safety	Safe. Replication incompetent: Uses 3 separate plasmids encoding   various HIV genes.	Safer. Replication incompetent and always SIN: Uses 4 plasmids instead   of 3 and eliminates the requirement for Tat.
LTR viral promoter	Wild   type	Hybrid:   5'LTR is partially deleted and fused to a heterologous enhancer/promoter such   as CMV or RSV

通過(guò)上面的對(duì)比，我們可以發(fā)現(xiàn)，核心區(qū)別2nd慢病毒需要TAT，而3nd慢病毒不需要TAT；2^nd中的gag、pol、rev、tat在一個(gè)質(zhì)粒，而3nd慢病毒體系中，gag\pol為同在一個(gè)質(zhì)粒，而rev在一個(gè)質(zhì)粒中。

那么這個(gè)Tat發(fā)揮了什么作用了呢？為什么3nd慢病毒就可以不依靠它了呢？

我們先來(lái)看看HIV 基因組是如何復(fù)制的？

https://viralzone.expasy.org/5061

這個(gè)圖顯示是HIV ssRNA，逆轉(zhuǎn)錄得到dsDNA的過(guò)程：

首選DNA->RNA轉(zhuǎn)錄，需要一個(gè)“引子”，比如真核生物轉(zhuǎn)錄所需要的引物酶（primase），病毒利用的是宿主的tRNA，tRNA結(jié)合到PBS上，tRNA充當(dāng)了引物，從tRNA的5’-3’合成一段DNA，這段DNA和HIV的LTR的R-U5配對(duì)。

然后這個(gè)R-U5-tRNA的分子“跳躍”到HIV ssRNA的3’端繼續(xù)依靠R配對(duì)，生成DNA，這里注意寫(xiě)到的RNA引物額外攜帶了新生的U5。新生的DNA和RNA形成DNA:RNA雜交鏈，隨后RNA基本上被RNaseH降解，而在多聚嘧啶PPT剩余部分RNA充當(dāng)引物，繼續(xù)合成DNA，此時(shí)DNA攜帶了U3-R-U5，成為了完整的3‘LTR。隨后這個(gè)DNA發(fā)生”跳躍”到HIV DNA的5‘端，通過(guò)形成PBS雜交DNA:DNA，繼續(xù)得到dsDNA，此時(shí)dsDNA的兩端都是完整的LTR。

然后我們要知道dsDNA如果整合到宿主基因組后，HIV的U5類(lèi)似啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)錄HIV DNA生成RNA。有兩個(gè)問(wèn)題：1）5‘LTR的U3啟動(dòng)HIV DNA 轉(zhuǎn)錄，但是3’ LTR的U3也會(huì)啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，如果下游是抑癌基因則有風(fēng)險(xiǎn)。2）U3啟動(dòng)HIV DNA轉(zhuǎn)錄效率低下。

宿主依靠TAT提高轉(zhuǎn)錄水平：當(dāng)病毒的DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄機(jī)器（RNA聚合酶II）會(huì)開(kāi)始讀取病毒基因，合成病毒RNA。遇到“卡頓”：但在沒(méi)有Tat的情況下，這個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程在病毒基因的起始階段非常緩慢、低效，經(jīng)常中途停止，只能產(chǎn)生非常短小的RNA片段。這就像一輛車(chē)剛啟動(dòng)就熄火，無(wú)法跑完全程。Tat蛋白會(huì)特異性結(jié)合到這些剛合成出來(lái)的、短小的病毒RNA的一個(gè)特殊區(qū)域，稱(chēng)為 TAR。Tat-TAR的結(jié)合就像一個(gè)“救援信號(hào)”，它會(huì)招募一大群宿主細(xì)胞的輔助因子（如P-TEFb）。這個(gè)復(fù)合體（Tat + TAR + 宿主因子）能極大地提升RNA聚合酶的“工作效率”。

 舉例子：

HIV野生型的基因組ssRNA結(jié)構(gòu)

這里需要特別注意R-U5，5端獨(dú)特序列（Unique to the 5’ end）；U3-R中的3‘ 端獨(dú)特序列（Unique to the 3’ end）。

當(dāng)HIV基因組整合到宿主基因組后，前病毒就變成了宿主細(xì)胞的一部分(即DNA序列)。這時(shí)，dsDNA序列的5端是U3-R-U5-genome-U3-R-U5(見(jiàn)上HIV 基因組逆轉(zhuǎn)錄的示意圖).

HIV整合后轉(zhuǎn)錄時(shí)，U3區(qū)域發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活啟動(dòng)子的作用：U3區(qū)域內(nèi)包含了許多關(guān)鍵的調(diào)控序列，可以結(jié)合宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB, SP1等），并且這個(gè)轉(zhuǎn)錄活性依然不足夠，病毒自身的Tat蛋白（通過(guò)TAR元件，位于R區(qū)）。當(dāng)這些因子結(jié)合到U3區(qū)域后，它們會(huì)招募細(xì)胞的RNA聚合酶II，啟動(dòng)病毒基因的轉(zhuǎn)錄。

第二代慢病毒的質(zhì)粒圖譜

Addgene的pWPT-GFP (Plasmid #12255)

這個(gè)是二代2nd病毒目的載體。5’LTR是完整的LTR(即U3-R-U5)，truncated 3’LTR(R-U5)缺少U3。如果這個(gè)載體進(jìn)行慢病毒包裝，那么就相當(dāng)于HIV在宿主基因中轉(zhuǎn)錄出來(lái)ssRNA包裝進(jìn)入慢病毒中，ssRNA的結(jié)構(gòu)是：R-U5-GOI(Gene of Interest)-R。在這個(gè)過(guò)程中，需要完全依靠包裝載體自帶的5’LTR的U3啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，所需需要加入TAT協(xié)助轉(zhuǎn)錄得到更多的ssRNA，提高病毒產(chǎn)量。

當(dāng)這個(gè)ssRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后得到dsRNA，其結(jié)構(gòu)是：R-U5-GOI-R-U5。這樣目的基因就依靠自身的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄（比如這里的EF1A），而3’LTR并沒(méi)有U3，所以也不會(huì)對(duì)下游基因產(chǎn)生激活轉(zhuǎn)錄。

第三代慢病毒的質(zhì)粒圖譜

Addgene的pLVpuro-CMV-N-EGFP(Plasmid #122848)

這個(gè)是二代3nd病毒目的載體。5’LTR是truncated LTR(即R-U5)，3’LTR(U3.truncated-R-U5)，根據(jù)生物過(guò)程，這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，因?yàn)?LTR缺少U3，他是無(wú)法轉(zhuǎn)錄出ssRNA的，那么怎么辦呢？這里額外加入外源強(qiáng)啟動(dòng)子RSV-promoter等轉(zhuǎn)錄出的ssRNA。這個(gè)ssRNA的結(jié)構(gòu)是R3-U5-GOI-U3.truncated-R，因?yàn)檫@個(gè)U3.truncated很短已經(jīng)缺少激活能力，所有也不會(huì)激活下游基因。因?yàn)槁�病毒�?’LTR已經(jīng)缺少U3且用了外源強(qiáng)啟動(dòng)子, 那么自然也就不需要TAT了。

第二代、第三代慢病毒都需要的rev是什么

Rev是ssRNA轉(zhuǎn)錄后運(yùn)輸出細(xì)胞核的關(guān)鍵。

   Once inserted, the viral DNA can be transcribed as one long RNA molecule by the host cell’s RNA polymerase II. This transcript is then spliced in many different ways to produce more than 30 different species of mRNA, which in turn are translated into a variety of different proteins. In order to make progeny virus, entire unspliced viral transcripts must be exported from the nucleus to the cytosol, where they are packaged into viral capsids and serve as the viral genome.

  The block is overcome by a viral-coded protein (called Rev) that binds to a specific RNA sequence (called the Rev response element; RRE) located within a viral intron. The Rev protein interacts with a nuclear export receptor (Crm1), which directs the movement of viral RNAs through nuclear pores into the cytosol despite the presence of intron sequences.

慢病毒制備In vivo CAR-T
核心原理

慢病毒的VSV-G結(jié)合LDL-R通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程分解動(dòng)作是：VSV-G結(jié)合LDL-R，然后病毒粒子在endosome里面通過(guò)VSV-G結(jié)構(gòu)變化然促進(jìn)病毒膜和endosome膜融合。慢病毒in vivo感染的原理核心是：對(duì)VSV-G的結(jié)合LDL-R的能力破壞，保留VSV-G融合能力。

靶向分子CD3、CD5、CD7等scFV、CD3 VHH可以獨(dú)立表達(dá)在細(xì)胞上，病毒粒子出膜的時(shí)候自然攜帶了這些分子。

In vivo慢病毒靶向T細(xì)胞是否需要激活T細(xì)胞
雖然慢病毒可以感染非復(fù)制的細(xì)胞，但是因?yàn)門(mén)細(xì)胞靜息時(shí)染色質(zhì)開(kāi)放程度低，自然是需要T細(xì)胞激活更好，但是是否需要強(qiáng)烈激活，應(yīng)該是不需要。溫和的激活是有效的，過(guò)度的激活是無(wú)益處的。

靶向T細(xì)胞的CD3抗體有多少
根據(jù)專(zhuān)利檢索，潛在越有300多個(gè)靶向CD3的各種形式的抗體（按照同族專(zhuān)利計(jì)算）。

需要考慮的是：
1）靶向CD3的分子最好是能夠激發(fā)CD3符合的內(nèi)吞，盡量快速完成病毒粒子的內(nèi)吞。
2）靶向CD3的抗體最好是能夠溫和或者較強(qiáng)激活T細(xì)胞，促進(jìn)感染效率。
3）靶向CD3的抗體親和力不需要很高，適中即可。因?yàn)椴《镜某瞿�、感染等，高親和力的靶向會(huì)感染病毒的感染路徑，比如影響了病毒的endosome逃逸。​