多組學(xué)解析宮頸鱗癌腫瘤細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)及其臨床價(jià)值

期刊：Nature Genetics
影響因子：29
主要技術(shù)：10x 3′ scRNA-seq   Stereo-seq 空間轉(zhuǎn)錄組  空間蛋白組

科學(xué)問題
宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）中腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性如何影響腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），并進(jìn)而影響免疫治療的療效？

實(shí)驗(yàn)材料和方法
14 例初治 CSCC 新鮮手術(shù)標(biāo)本 + 3 例健康宮頸：10x 3′ scRNA-seq
同上組織（OCT 包埋 10 μm 片）：Stereo-seq 空間轉(zhuǎn)錄組
60 個(gè)激光捕獲微切割（LCM）ROI（免疫富集區(qū) 40 個(gè)、免疫貧乏區(qū) 20 個(gè)）：空間蛋白組

導(dǎo)語
同一批宮頸鱗癌，有的對(duì)免疫治療“冷若冰霜”，有的卻“熱情響應(yīng)”。同濟(jì)團(tuán)隊(duì)發(fā)表Nature Genetics 研究用單細(xì)胞+空間多組學(xué)給腫瘤“拍CT”，揪出兩種決定免疫命運(yùn)的核心細(xì)胞狀態(tài)——MP6（冷）與MP7（熱）。機(jī)制上，MP6通過FABP5-TGFβ信號(hào)把免疫細(xì)胞擋在瘤外；臨床上，一次新輔助化療即可“降溫轉(zhuǎn)熱”，顯著提增PD-1療效。這項(xiàng)工作為精準(zhǔn)免疫治療提供了可量化的分子標(biāo)尺和可成藥的新靶點(diǎn)。

主要技術(shù)
10x 3′ scRNA-seq   Stereo-seq 空間轉(zhuǎn)錄組  空間蛋白組

研究結(jié)果
1. CSCC單細(xì)胞圖譜
研究團(tuán)隊(duì)對(duì)14例未經(jīng)治療的宮頸鱗癌及3例健康宮頸組織進(jìn)行10x scRNA-seq（圖1a-b），質(zhì)控后獲得163,880個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞，并基于經(jīng)典marker注釋出50種亞型、14大細(xì)胞譜系�？截悢�(shù)與突變分析（擴(kuò)展圖1d-e）證實(shí)腫瘤特異性。

2. CSCC惡性區(qū)室內(nèi)的元程序
惡性上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性會(huì)與腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）形成特定的相互作用，從而影響腫瘤的命運(yùn)。因此，我們開始評(píng)估宮頸鱗癌中鱗狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)多樣性。與以往研究一致，20,168個(gè)惡性鱗狀細(xì)胞根據(jù)其腫瘤來源明顯聚類，表現(xiàn)出腫瘤間的異質(zhì)性（圖1c）。通過對(duì)每個(gè)惡性細(xì)胞應(yīng)用非負(fù)矩陣分解（NMF），我們識(shí)別出8種不同的“元程序”（MP1–8），它們反映了不同腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性的共同模式（圖1d）。值得注意的是，這些元程序也可以通過其他聚類方法穩(wěn)定地識(shí)別出來（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a,b）。其中三個(gè)元程序（MP6、MP7 和 MP8）代表了鱗狀分化的不同階段，其特征基因主要由角蛋白、黏蛋白和富含脯氨酸的小蛋白家族等上皮標(biāo)志物組成（圖1d）。MP6（上皮-角蛋白型）與頭頸鱗癌的HNSCC_epi2特征高度一致，但與泛癌研究中的上皮衰老（Epi-Sen）狀態(tài)相似度較低，富集角化相關(guān)基因，突出其鱗癌特異性。MP8（上皮衰老型）與頭頸鱗癌的HNSCC_epi1狀態(tài)和泛癌的衰老上皮狀態(tài)相似，表現(xiàn)出與HPV狀態(tài)相關(guān)的衰老特征。MP7（上皮-免疫型）表達(dá)多種與免疫細(xì)胞相關(guān)的分子（如HLA-DRB、B2M和IDO1），表明其與免疫反應(yīng)有關(guān)。此外，MP7同時(shí)表達(dá)鱗狀上皮標(biāo)志物（如KRT5和KRT6）和腺體標(biāo)志物（如MUC1、MUC16和WFDC2）。MP7與泛癌免疫信號(hào)和干擾素（IFN）反應(yīng)細(xì)胞不同，表明它可能代表一種此前未被報(bào)道的、獨(dú)特的免疫相關(guān)上皮狀態(tài)。

圖1 單細(xì)胞RNA測(cè)序解析細(xì)胞圖譜，為揭示宮頸鱗癌異質(zhì)性提供全新視角

3. MP6 和 MP7 與不同的腫瘤免疫表型（TIP）相關(guān)
除了數(shù)量，CD8+ T 細(xì)胞的空間分布對(duì)免疫微環(huán)境分層和免疫治療反應(yīng)也很關(guān)鍵。為了評(píng)估 MP 與 TIP 的關(guān)系，我們根據(jù) CD8+ T 細(xì)胞的分布位置為每個(gè)腫瘤分配了一個(gè) TIP 類型，浸潤型 TIP 的 CD8+ T 細(xì)胞數(shù)量顯著更多，排斥/荒漠型腫瘤中 MP6 細(xì)胞比例更高，而浸潤型腫瘤中 MP7 細(xì)胞比例更高（圖2）。MP6/MP7 的比例，直接決定了腫瘤對(duì)免疫治療的“開門”程度。

圖2 MP7狀態(tài)與大量趨向細(xì)胞毒性/耗竭狀態(tài)的腫瘤浸潤性T細(xì)胞密切相關(guān)

4. MP7的空間分布特征不同于常規(guī)的"免疫熱"特征
為了在空間水平評(píng)估MP6、MP7與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，我們把單細(xì)胞數(shù)據(jù)與15例CSCC的Stereo-seq空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合。MP7區(qū)域周圍CD4 T、CD8 T、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞明顯更多（圖3b–f）。相反，MP6區(qū)域與免疫細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖3g–h）。CytoSPACE映射顯示，CD4和CD8 T細(xì)胞明顯聚集在MP7區(qū)域。此外，MP7區(qū)域內(nèi)的CD4和CD8 T細(xì)胞表現(xiàn)出耗竭信號(hào)。MP6高表達(dá)SERPINB3和FABP5，MUC4染色稀少，幾乎沒有CD8 T細(xì)胞浸潤。

圖3 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示MP6和MP7與免疫細(xì)胞浸潤存在截然相反的關(guān)聯(lián)

5. MP6中TGFβ信號(hào)(轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào))被激活
MP6腫瘤細(xì)胞富集角化相關(guān)基因表達(dá)（如 FABP5、SERPINB3、KRT6B 等）， MP7腫瘤細(xì)胞高表達(dá)抗原提呈和免疫反應(yīng)相關(guān)基因。PROGENy通路分析顯示發(fā)現(xiàn)MP6型腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞稀少的區(qū)域中TGF-β信號(hào)更強(qiáng)，提示其可能參與免疫抑制。TGF-β信號(hào)介導(dǎo)免疫抑制，而FABP5在腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中增強(qiáng)該通路活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，TGF-β信號(hào)在MP6型腫瘤中有助于形成免疫排斥型微環(huán)境。在空間轉(zhuǎn)錄組和蛋白組中，MP6區(qū)域和免疫貧瘠區(qū)都一致顯示TGFβ信號(hào)增強(qiáng)（圖4f–g）。并且GF-β 信號(hào)強(qiáng)度在 MP6 腫瘤區(qū)域的邊緣最為突出（圖 4g），暗示該通路可重塑腫瘤周圍微環(huán)境，影響癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）及免疫細(xì)胞的功能與分布。

圖4 多模態(tài)腫瘤狀態(tài)分析證實(shí) MP6 腫瘤存在 TGFβ 信號(hào)激活

6. 癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）強(qiáng)化了MP6區(qū)域周邊的免疫抑制微環(huán)境
近期研究發(fā)現(xiàn)，不同表型的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）與不同的腫瘤免疫表型（TIP）密切相關(guān)。我們共鑒定到 7 個(gè)成纖維細(xì)胞亞群，其中 3 個(gè)（CAF-CD34、CAF-DES、CAF-MMP11）在宮頸鱗癌中特異性擴(kuò)張。CAF-MMP11高表達(dá)MMP11、POSTN、CTHRC1、COL8A1、COL10A1等TGF-β誘導(dǎo)的反應(yīng)性基質(zhì)基因，并富集上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)通路（圖5d,e）。此外，該亞群還高表達(dá)LRRC15（圖5f），可直接抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，CAF-MMP11被定義為免疫抑制型CAF�？臻g轉(zhuǎn)錄組顯示，MP6 腫瘤周邊的成纖維細(xì)胞顯著高表達(dá)免疫抑制 CAF 特征（圖 5g 左）。單細(xì)胞空間映射進(jìn)一步證實(shí)，CAF-MMP11 主要富集在 MP6 區(qū)域的腫瘤-基質(zhì)交界帶，而 MP7 周圍無此現(xiàn)象（圖 5g 右）。相關(guān)性分析表明，MP6 得分與成纖維細(xì)胞鄰區(qū)內(nèi)的免疫抑制 CAF 特征呈顯著正相關(guān)（r = 0.55，P = 3.8 × 10⁻⁷）（圖 5h）。此外，細(xì)胞互作分析揭示 MP6 灶邊緣的 TGF-β 信號(hào)顯著升高。

圖5 MP6腫瘤邊緣的免疫抑制型CAF形成免疫排斥微環(huán)境

7. MP6/7 評(píng)分具有臨床相關(guān)性
為了進(jìn)一步探索腫瘤狀態(tài)與免疫表型的特異性關(guān)聯(lián)，我們利用 BayesPrism 工具從 bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)中提取腫瘤細(xì)胞特異性基因譜，并解析每個(gè)腫瘤中 MP6 與 MP7 的成分。我們定義了一個(gè)評(píng)分（MP6/7 評(píng)分），用于衡量每個(gè)腫瘤中 MP6 相對(duì)于 MP7 的富集程度（MP6/7 評(píng)分 = MP6 特征強(qiáng)度 − MP7 特征強(qiáng)度，越高代表腫瘤越偏向“冷”表型。）。MP6/7 評(píng)分高的腫瘤表現(xiàn)出免疫激活和免疫逃逸相關(guān)基因表達(dá)下降，免疫細(xì)胞浸潤減少，而免疫排斥相關(guān)的基質(zhì)成分增加（圖6a）。在宮頸鱗癌隊(duì)列中，CD8⁺ T 細(xì)胞浸潤與 MP6/7 評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（r = –0.47，P = 0.037）(圖6c)。TCGA-CESC 數(shù)據(jù)重復(fù)了上述結(jié)果，且在兩項(xiàng)鱗狀非小細(xì)胞肺癌免疫治療試驗(yàn)（OAK 與 POPLAR）中，低 MP6/7 評(píng)分預(yù)示免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效更佳（圖 6d-f）。新輔助化療顯著降低 CSCC 患者的 MP6/7 評(píng)分，其中評(píng)分下降最顯著者隨后在接受免疫治療時(shí)達(dá)到病理完全緩解。此外，MP6/7 評(píng)分與角化程度相關(guān)，與 MP6 富集角化基因的結(jié)果一致。

圖6 MP6腫瘤細(xì)胞表型與免疫浸潤呈負(fù)相關(guān)，這一現(xiàn)象在多個(gè)CSCC數(shù)據(jù)集中得到驗(yàn)證

8. FABP5 維持 MP6 腫瘤狀態(tài)的核心驅(qū)動(dòng)作用
在宮頸鱗癌中，MP6 與 MP7 腫瘤狀態(tài)更多與表觀遺傳修飾相關(guān)，而非基因組多樣性。 我們接著解析 MP6 狀態(tài)的核心特征。除角化相關(guān)基因外，還包含 SERPINB3 和 S100A8/A9，二者均與宮頸鱗癌晚期及不良預(yù)后相關(guān)。有趣的是，差異表達(dá)最顯著的轉(zhuǎn)錄本與蛋白之一是 FABP5 (Fig. 4a,d)，該脂肪酸結(jié)合蛋白已在多種腫瘤中被報(bào)道。敲低 FABP5 后，MP6 特征得分下降最為顯著，且宮頸鱗癌及頭頸鱗癌細(xì)胞系中相應(yīng)蛋白水平也大幅降低（圖 7a、b）。FABP5 選擇性抑制劑 FABP5-IN-1 可抑制宮頸鱗癌患者來源類器官的生長，并伴隨 S100A8/A9 和 SERPINB3 的下調(diào)（圖 7c、d）。基因敲除或藥物抑制 FABP5 均顯著降低 TGFβ（特別是 TGFβ2 亞型）及其下游 pSMAD2/3 信號(hào)（圖 7e–h）。FABP5 敲除腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基無法誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)免疫抑制性 CAF 標(biāo)志，說明 FABP5 依賴的 TGFβ 活性是 CAF 轉(zhuǎn)化的必要條件。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，抑制或敲除 FABP5 顯著降低腫瘤負(fù)荷，增加 CD4⁺ 與 CD8⁺ T 細(xì)胞浸潤，并在免疫功能正常的小鼠中幾乎完全阻止腫瘤生長（圖 7j–n）。

圖7  FABP5是維持MP6狀態(tài)的關(guān)鍵因子，并參與激活TGFβ信號(hào)通路及與免疫抑制性CAF的相互作用。

結(jié)語
本項(xiàng)研究通過整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、空間蛋白質(zhì)組等多組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)性地繪制了宮頸鱗癌（CSCC）的高分辨率細(xì)胞圖譜，并揭示了其內(nèi)部的關(guān)鍵異質(zhì)性。研究成功鑒定出三種具有重要生物學(xué)和臨床意義的腫瘤細(xì)胞狀態(tài)（MP6, MP7, MP8），其中MP6（上皮-角蛋白型）與免疫排斥微環(huán)境相關(guān)，而MP7（上皮-免疫型）則與免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)。研究進(jìn)一步闡明了其背后的分子機(jī)制：MP6細(xì)胞通過FABP5-TGFβ信號(hào)軸與周圍的免疫抑制性癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）形成雙向正反饋循環(huán)，共同構(gòu)筑了一個(gè)“免疫隔離區(qū)”；而MP7細(xì)胞則通過干擾素等信號(hào)與免疫細(xì)胞積極互動(dòng)。

更重要的是，本研究超越了基礎(chǔ)機(jī)制的探索，展現(xiàn)了巨大的臨床轉(zhuǎn)化潛力�；�于此發(fā)現(xiàn)的MP6/7評(píng)分不僅能作為預(yù)測(cè)免疫治療響應(yīng)的新型生物標(biāo)志物，還揭示了新輔助化療可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞狀態(tài)從MP6向MP7發(fā)生有利轉(zhuǎn)換，從而為聯(lián)合治療策略提供了理論依據(jù)。最后，研究證實(shí)靶向FABP5能有效逆轉(zhuǎn)MP6狀態(tài)、抑制腫瘤生長并促進(jìn)T細(xì)胞浸潤，為治療免疫“冷”腫瘤提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。這項(xiàng)工作不僅深化了我們對(duì)宮頸鱗癌腫瘤生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜性的理解，更開創(chuàng)了一個(gè)將腫瘤細(xì)胞內(nèi)在狀態(tài)與免疫微環(huán)境聯(lián)系起來的研究范式，為改善宮頸癌患者的精準(zhǔn)分型和免疫治療策略提供了強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
Fan J, Lu F, Qin T, Peng W, Zhuang X, Li Y, Hou X, Fang Z, Yang Y, Guo E, Yang B, Li X, Fu Y, Kang X, Wu Z, Han L, Mills GB, Ma X, Li K, Wu P, Ma D, Chen G, Sun C. Multiomic analysis of cervical squamous cell carcinoma identifies cellular ecosystems with biological and clinical relevance. Nat Genet. 2023 Dec;55(12):2175-2188. doi: 10.1038/s41588-023-01570-0. Epub 2023 Nov 20. PMID: 37985817.