果蠅單細(xì)胞三維時(shí)空多組學(xué)圖譜揭示細(xì)胞類型分化的全景關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

期刊：Cell
影響因子：45.5
主要技術(shù)：Stereo-seq、scRNA-seq、scATAC-seq

導(dǎo)語
多細(xì)胞生物的發(fā)育是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，受到無數(shù)基因和通路在空間和時(shí)間上的嚴(yán)格調(diào)控。單細(xì)胞水平上基因表達(dá)的空間環(huán)境對(duì)于理解其生物學(xué)相關(guān)性至關(guān)重要，但在標(biāo)準(zhǔn)的單細(xì)胞測(cè)序過程中往往丟失。以前，我們利用了空間增強(qiáng)分辨率組學(xué)測(cè)序（Stereo-seq），一種基于測(cè)序和模式化 DNA 納米球（DNB）陣列的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)，具有高空間分辨率和靈敏度，來解決這個(gè)問題。在這里，我們將對(duì)果蠅時(shí)空轉(zhuǎn)錄組的研究擴(kuò)展到覆蓋其從胚胎到蛹期的整個(gè)發(fā)育過程。我們使用 Stereo-seq 和 Spateo，這是一個(gè)用于分析單細(xì)胞多模態(tài)數(shù)據(jù)的計(jì)算流程，重建了單細(xì)胞空間分辨率的3D轉(zhuǎn)錄組。我們進(jìn)一步將單細(xì)胞 Stereo-seq（scStereo-seq）數(shù)據(jù)與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（scATAC-seq）數(shù)據(jù)相結(jié)合，創(chuàng)建了一個(gè)果蠅胚胎發(fā)生的多組學(xué)圖譜。這個(gè)圖譜包括超高通量空間背景下轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳信息，這使我們能夠建立多組學(xué)細(xì)胞狀態(tài)軌跡，并具有相關(guān)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空動(dòng)態(tài)。

為了從 3D 時(shí)空多組學(xué)的角度闡明各種細(xì)胞類型的發(fā)育調(diào)控，我們將中腸作為研究的模型。果蠅中腸通過不同類型的細(xì)胞和它們形成的區(qū)域發(fā)揮著多種功能，例如吸收營(yíng)養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞（ECs）、感知刺激和分泌激素的腸內(nèi)分泌細(xì)胞（EEs）以及與金屬離子穩(wěn)態(tài)和胃酸分泌相關(guān)的銅細(xì)胞。在變態(tài)過程中，幼蟲中腸細(xì)胞經(jīng)歷自噬依賴性細(xì)胞死亡，成年中腸細(xì)胞則從一群專門指定的干細(xì)胞中重新構(gòu)成，這些干細(xì)胞被稱為成年中腸祖細(xì)胞（AMPs）。然而，分化的時(shí)機(jī)和調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。我們重點(diǎn)關(guān)注發(fā)育中的中腸，從多組學(xué)角度研究了其細(xì)胞類型多樣化、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRNs）和區(qū)域化。通過多模態(tài)分析，我們確定了參與中腸發(fā)育細(xì)胞類型特異性調(diào)控的多個(gè)潛在因素，并通過突變分析驗(yàn)證了同源框（HD）轉(zhuǎn)錄因子（TF）exex 是銅細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。這個(gè)廣泛的圖譜提供了一個(gè)豐富的資源，并作為系統(tǒng)平臺(tái)，用于研究具有超高通量時(shí)空分辨率的集成單細(xì)胞數(shù)據(jù)的果蠅發(fā)育。

主要技術(shù)
Stereo-seq、scRNA-seq、scATAC-seq

研究結(jié)果
1. 以單細(xì)胞分辨率重建從胚胎發(fā)育到變態(tài)階段的果蠅三維空間轉(zhuǎn)錄組
為了構(gòu)建果蠅發(fā)育的多組學(xué)圖譜，我們首先通過收集發(fā)育階段不同的樣本，包括胚胎（0.5 到 2 小時(shí)間隔）、幼蟲（L1 到 L3 的早期和晚期階段）和蛹（P12 到 P72），來擴(kuò)展和增強(qiáng) 3D 空間轉(zhuǎn)錄組（圖 1A）。為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞空間分辨率，我們對(duì)每個(gè)芯片進(jìn)行了核染色和細(xì)胞分割，從而允許進(jìn)行更精確的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。利用 Stereo-seq 平臺(tái)，我們生成了 43 個(gè)胚胎、9 個(gè)幼蟲和 5 個(gè)蛹樣品的全器官單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組，總共有 3812505 個(gè)細(xì)胞單元（圖 1A）。然后，我們將來自單個(gè)樣本所有切片的細(xì)胞單元組合起來，基于基因表達(dá)譜和空間位置進(jìn)行無監(jiān)督聚類，并手動(dòng)注釋聚類。通過將空間位置和細(xì)胞注釋與 Spateo 結(jié)合，我們實(shí)現(xiàn)了 3D 空間轉(zhuǎn)錄組來重建具有精細(xì)解剖形態(tài)的各種組織（圖 1A）�；�于這個(gè)全面的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，我們生成了一個(gè)在已建立的 in situ 數(shù)據(jù)庫(kù)中未報(bào)道空間表達(dá)模式的 338 個(gè)基因列表，并在 3D 中重建了它們的模式。因此，我們?yōu)楣�蠅樣品生成�?3D 空間轉(zhuǎn)錄組，涵蓋了從胚胎到蛹的整個(gè)發(fā)育階段。
 

圖 1

2. 果蠅胚胎發(fā)育的單細(xì)胞時(shí)空多組學(xué)圖譜
為了用更深入的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組信息來增強(qiáng)我們的單細(xì)胞三維空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。我們?cè)谂咛グl(fā)生過程中，每隔2小時(shí)收集胚胎樣本，并對(duì)其進(jìn)行了基于滴液的scRNA-seq和scATAC-seq 測(cè)序（圖 1A）。經(jīng)過質(zhì)量控制后，我們獲得了238242個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其中scRNA-seq的中位數(shù)為每個(gè)細(xì)胞6841個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（UMIs）和 1707 個(gè)基因。我們還獲得了240573個(gè)單細(xì)胞染色質(zhì)可及性配置文件，其中 scATAC-seq 的中位數(shù)為每個(gè)細(xì)胞11772個(gè)片段。為了在幼蟲階段進(jìn)行更全面的分析，我們從 NP1-Gal4 > UAS-mCherry-shRNA（其中 NP1-Gal4 是中腸 EC 特異性驅(qū)動(dòng)器；shRNA，短發(fā)夾 RNA）的 L3 中腸中生成額外的控制 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集。經(jīng)過質(zhì)量控制措施，我們獲得了 17988 個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其中中位數(shù)為每個(gè)細(xì)胞8846個(gè)UMIs和1795個(gè)基因。

在胚胎發(fā)生過程中收集的聚合 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，我們首先進(jìn)行了粗略的無監(jiān)督聚類，并在 UMAP 圖中生成了 45 個(gè)細(xì)胞簇。我們對(duì)這些簇進(jìn)行了注釋，并在三個(gè)級(jí)別（細(xì)胞類型-組織-胚層）對(duì)注釋進(jìn)行了分類（例如，胃盲囊-中腸-內(nèi)胚層）（圖 1A）。我們還對(duì)聚合scATAC-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了粗略的無監(jiān)督聚類。類似地，我們?cè)?UMAP 圖中產(chǎn)生了40個(gè)不同注釋的簇（圖 1A）。我們收集的數(shù)據(jù)涵蓋了主要組織，這從每個(gè)組織所代表細(xì)胞的比例及其在發(fā)育階段的變化中可以看出（圖 1B）。

我們進(jìn)一步通過亞聚類分析了組織細(xì)胞類型異質(zhì)性。在scRNA-seq數(shù)據(jù)中，我們能夠廣泛地描述胚胎組織的細(xì)胞類型組成，包括稀有細(xì)胞類型。為了驗(yàn)證我們識(shí)別的亞簇，我們編制了一個(gè)在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都識(shí)別出的常見細(xì)胞類型標(biāo)記基因列表，并使用熒光原位雜交（FISH）驗(yàn)證了 3 個(gè)之前未報(bào)道的細(xì)胞類型標(biāo)記基因的表達(dá)特異性（圖 1C）�？傊�，我們生成了果蠅胚胎發(fā)生過程中 scStereo-seq、scRNA-seq 和 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集的綜合圖譜。我們多組學(xué)數(shù)據(jù)的高粒度和時(shí)間連續(xù)性為細(xì)胞類型和發(fā)育年齡依賴的這些多組學(xué)數(shù)據(jù)整合打開了可能性。

3.多組學(xué)數(shù)據(jù)集成與構(gòu)建組織分化軌跡
為了整合 scStereo-seq 和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，我們使用 NovoSpaRc 選擇推斷發(fā)育年齡差異為 1 小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行整合。為了評(píng)估這種整合，我們選擇了 9 個(gè)之前未表征的組織特異性基因，并使用 FISH 建立了它們表達(dá)模式的基準(zhǔn)。我們發(fā)現(xiàn)，與僅使用 scStereo-seq 數(shù)據(jù)相比，整合數(shù)據(jù)明顯減少了信號(hào)背景，增強(qiáng)了組織富集，并改善了空間模式，使其與 FISH 結(jié)果更加相似（圖 1D ）。

為了整合 scRNA-seq 和 scATAC-seq 數(shù)據(jù)，我們將 scATAC-seq 峰矩陣中的表達(dá)矩陣進(jìn)行插補(bǔ)，并將其與 scRNA-seq 表達(dá)矩陣共嵌入同一UMAP 空間進(jìn)行聚類（圖 2A）。接下來，我們旨在將 scRNA-seq 和 scATAC-seq 數(shù)據(jù)中每個(gè)胚層的所有胚胎組織細(xì)胞狀態(tài)組織成連續(xù)的發(fā)育軌跡。我們將 PhyloVelo29 應(yīng)用于整合數(shù)據(jù)，為三個(gè)胚層建立了速度矢量場(chǎng)，并根據(jù)標(biāo)記基因重新注釋細(xì)胞簇以及它們沿速度軌跡的順序。有了這些速度矢量，我們能夠確定每個(gè)組織的分化軌跡，并將細(xì)胞類型按時(shí)間順序排列（圖 2B）。由于細(xì)胞類型分化的復(fù)雜性，細(xì)胞類型分化分支在 3D UMAP 空間中可視化效果更好。這些結(jié)果表明，我們的數(shù)據(jù)集可以作為探索細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)框架。
 

圖 2

4. 組織分化過程中細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄因子活性
為了解析沿組織分化軌跡由 TFs 指導(dǎo)的細(xì)胞類型特異性調(diào)控活動(dòng)，我們仔細(xì)審查了我們的整合 scRNA-seq/scATAC-seq 數(shù)據(jù)。我們首先在 scATAC-seq 數(shù)據(jù)中識(shí)別了表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性活動(dòng)的 TF 結(jié)合基序。我們進(jìn)一步通過 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中細(xì)胞類型標(biāo)記基因的靶基因富集過濾候選 TF 列表。這種整合分析中重疊的候選 TF 代表了沿分化路徑最活躍的細(xì)胞類型特異性 TF，包括既定的調(diào)節(jié)因子和尚未表征的潛在因子（圖 2B）。

代表性的細(xì)胞類型特異性 TF 活動(dòng)包括 GATAe 在 Malpighian 腎管中的基序、Rfx 在外胚層 PNS 和 CNS 中的基序和 sage 在唾液腺中的基序。在中胚層中，我們發(fā)現(xiàn)了 Mef2 在軀體肌肉中的基序富集、bin在內(nèi)臟肌肉中的基序和 srp 在脂肪體和血細(xì)胞中的基序。內(nèi)胚層表現(xiàn)出 GATA 家族 TFs grn、fkh 和 GATAe 的基序富集，這些 TF 調(diào)節(jié)晚期內(nèi)胚層分化。我們還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)之前未表征的 TF，它們?cè)谂咛グl(fā)生過程中具有潛在的時(shí)空特異性功能。TF crp 在多個(gè)組織中廣泛表達(dá)，并已知在氣管管道中指定終細(xì)胞，在中胚層脂肪體和血細(xì)胞中表現(xiàn)出潛在的調(diào)控功能（圖 2C）。

為了進(jìn)一步探索這些 TF 的空間調(diào)控子活動(dòng)，我們將 SCENIC45 應(yīng)用于整合 scStereo-seq/scRNA-seq 數(shù)據(jù)，揭示了 TF 調(diào)控子活性的空間模式與組織特異性基序富集分析一致（圖 2D）。這些不太確定的 TF 的空間表達(dá)模式也通過伯克利果蠅基因組計(jì)劃（BDGP）原位數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了探查，所有這些 TF 在其推斷功能的階段都表現(xiàn)出弱信號(hào)或普遍表達(dá)模式。因此，我們的多組學(xué)數(shù)據(jù)為闡明這些 TF 的組織特異性調(diào)控作用提供了額外的證據(jù)。

隨后，我們將 Pando47應(yīng)用于整合 scRNA-seq/scATAC-seq 數(shù)據(jù)，深入探討了識(shí)別的 TF 的詳細(xì)調(diào)控子。在脂肪體和血細(xì)胞特異性調(diào)控子活動(dòng)中，我們發(fā)現(xiàn) crp 和 srp 位于同一 GRN 中。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn) srp 和 crp 的調(diào)控子中的靶基因在早期脂肪體中 largely 相互重疊，并且這種重疊在中胚層組織（包括脂肪體和血細(xì)胞）的發(fā)育軌跡中增加（圖 2E）。我們識(shí)別的 srp 的調(diào)控子與從早期脂肪體發(fā)育開始誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞形成的作用一致，crp已知影響細(xì)胞生長(zhǎng)和組織大小控制。我們的分析暗示 crp 和 srp 在脂肪體和血細(xì)胞發(fā)育過程中在同一個(gè) GRN 中的作用越來越協(xié)調(diào)。與這一發(fā)現(xiàn)一致，F(xiàn)ISH 結(jié)果證實(shí)了 crp 和 srp 表達(dá)細(xì)胞在晚期胚胎中的重疊（圖 2F）。通過追蹤組織分化軌跡，我們確定了在細(xì)胞類型分化過程中既定的和潛在的 TF，揭示了它們的組織特異性和協(xié)調(diào)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

5. 通過時(shí)空細(xì)胞類型圖譜研究組織分化的起源和模式
我們選擇了脂肪體（哺乳動(dòng)物肝臟的對(duì)應(yīng)物）和前腸/后腸（哺乳動(dòng)物胃/大腸的對(duì)應(yīng)物，兩者均為外胚層來源作為模型，并將它們的細(xì)胞類型與胚胎 scStereo-seq 樣本進(jìn)行對(duì)齊（圖 3A 和 3B）。在各個(gè)發(fā)育階段對(duì)組織細(xì)胞類型進(jìn)行映射為在時(shí)空背景下檢查分化起源的分布提供了獨(dú)特的機(jī)遇。具體來說，具有集中分化起源（如干細(xì)胞）的組織將在發(fā)育的不同階段產(chǎn)生空間上不同的細(xì)胞類型。相比之下，具有分散分化起源的組織將在不同階段產(chǎn)生細(xì)胞類型的混合物（圖 3C）。

以前的研究確定，脂肪體細(xì)胞起源于在整個(gè)組織中延伸的重復(fù)片段中的祖細(xì)胞。這表明脂肪體分化是分散的。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用鄰域富集分析量化了脂肪體細(xì)胞類型的空間聚集水平，其中較高的分?jǐn)?shù)表示更高的空間聚集水平。我們發(fā)現(xiàn)脂肪體的鄰域富集水平較低。一致地，我們?cè)?3D 模型中發(fā)現(xiàn)，脂肪體細(xì)胞類型的各個(gè)階段分布分散且混合（圖 3A）。這進(jìn)一步得到了 scStereo-seq 數(shù)據(jù)中細(xì)胞單元 CytoTRACE 分?jǐn)?shù)的空間分布的支持。CytoTRACE 利用可檢測(cè)到的基因表達(dá)數(shù)量作為分化潛力的穩(wěn)健指標(biāo)。我們觀察到脂肪體 scStereo-seq 數(shù)據(jù)中具有不同分化潛力的細(xì)胞相互混合（圖 3D）。

另一方面，胚胎前腸/后腸分化起源的空間分布尚未完全繪制。以前的研究確定了成年腸道中消化道干細(xì)胞的生態(tài)位，其中在空間上定義的干細(xì)胞群分別產(chǎn)生成年前腸和后腸。也有報(bào)道稱，胚胎后腸來自受多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)的狹窄環(huán)狀區(qū)域，這些通路控制后腸節(jié)段的生長(zhǎng)。胚胎器官發(fā)生過程中腸道干細(xì)胞的數(shù)量和分化起源的位置仍然不清楚。我們的數(shù)據(jù)表明，前腸/后腸細(xì)胞類型具有顯著更高的鄰域富集。不同發(fā)育階段和分化潛能的細(xì)胞類型也表現(xiàn)出不同的空間分布（圖 3A 和 3D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，胚胎前腸/后腸以集中方式分化，為胚胎前腸和后腸中存在成簇而不是分散的分化起源提供了證據(jù)�？傊�，組織細(xì)胞類型的空間映射為分析分化起源和識(shí)別潛在干細(xì)胞生態(tài)位提供了直觀的視角。

圖 3

6. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)測(cè)量學(xué)中的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)變化
我們?cè)?7 個(gè) scStereo-seq 樣本中對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分析，這些樣本的發(fā)育年齡跨度從 7 小時(shí)到 18 小時(shí)。在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，我們觀察到最高加速區(qū)域從 VNC 的后端（E8.84 之前）轉(zhuǎn)移到大腦的前端（E13.79 之后）（圖 3E）。VNC 中加速和曲率分?jǐn)?shù)的下降可能與胚帶收縮的完成有關(guān)，這表明早期發(fā)育過程中 VNC 的縮短主要依賴于后部細(xì)胞向前端遷移。相反，大腦前端區(qū)域加速和曲率分?jǐn)?shù)的增加可能反映了晚期胚胎發(fā)生過程中大腦葉的細(xì)胞組織活動(dòng)（圖 3E）。正如預(yù)期中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)一樣，最高曲率和曲率分?jǐn)?shù)的區(qū)域集中在 VNC 和大腦之間的彎曲關(guān)節(jié)處。形態(tài)學(xué)分析產(chǎn)生了一組與中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)計(jì)量動(dòng)力學(xué)相關(guān)的時(shí)空表達(dá)變化基因。GO富集分析顯示，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)計(jì)量變化相關(guān)的基因在細(xì)胞命運(yùn)決定和模式形成中高度富集。值得注意的是，基因表達(dá)術(shù)語在早期階段更富集，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)術(shù)語在后期階段更富集。這些觀察結(jié)果表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生過程與內(nèi)在細(xì)胞命運(yùn)決定密切相關(guān)。這得到了已知中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)因子（例如，mira、tll 和 toy）對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)計(jì)量分?jǐn)?shù)的貢獻(xiàn)的進(jìn)一步支持。此外，我們識(shí)別了多個(gè)未表征的因子。例如，編碼未表征跨膜蛋白的 CG42394 的表達(dá)水平與加速呈負(fù)相關(guān)，而 lncRNA:CR30009 的表達(dá)水平與加速呈正相關(guān)（圖 3F）。我們使用 FISH 驗(yàn)證了這些潛在調(diào)節(jié)因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的特異性表達(dá)，并觀察到 CG42394 表現(xiàn)出分段表達(dá)模式，而 lncRNA:CR30009 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中更普遍地表達(dá)（圖 3G）。值得注意的是，潛在形態(tài)計(jì)量調(diào)節(jié)因子列表中除了 lncRNA:CR30009（之前報(bào)道在膠質(zhì)細(xì)胞中富集并共定位與膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因 repo）之外，還包括多個(gè)長(zhǎng)非編碼 RNA（lncRNA）基因。在我們 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中檢查這些 lncRNA 基因時(shí)，我們觀察到 lncRNA:CR30009 和 lncRNA:CR45388 的表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞和膠質(zhì)母細(xì)胞標(biāo)記基因的相關(guān)性最高。我們進(jìn)一步使用 FISH 確認(rèn)了它們與神經(jīng)母細(xì)胞標(biāo)記基因 mira 和 cas 的共定位（圖 3H）。這些觀察結(jié)果表明，這兩個(gè) lncRNA 基因可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞遷移。

因此，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)計(jì)量分析提供了一個(gè)獨(dú)特的視角來研究與細(xì)胞遷移相關(guān)的基因，并確定了已知和潛在的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)因子。

7. 胚胎中腸細(xì)胞亞群的基因表達(dá)與空間布局
果蠅中腸是研究細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制廣泛使用的模型。在胚胎中腸發(fā)育過程中，細(xì)胞類型的解剖形態(tài)和空間分布高度動(dòng)態(tài)（圖 4A）。在各種中腸細(xì)胞類型中，內(nèi)分泌細(xì)胞（EEs）和腸上皮細(xì)胞（ECs）可以根據(jù)它們的標(biāo)記基因和在成體中的生理功能進(jìn)一步分類為多個(gè)亞類。然而，它們?cè)谂咛ズ陀紫x發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化仍然不清楚。在這里，我們首先旨在將胚胎中腸細(xì)胞類型分類為亞類，并使用 Dynamo 描繪它們的分化動(dòng)態(tài)。我們集中在中腸 scRNA-seq 數(shù)據(jù)上進(jìn)行高分辨率亞聚類、注釋和細(xì)胞狀態(tài)譜系描述（圖 4B）。這揭示了發(fā)育中中腸的 23 個(gè)細(xì)胞亞簇，并確定了 AMPs（由 esg 標(biāo)記）、EEs（由 pros 標(biāo)記并由特定內(nèi)分泌基因表達(dá)區(qū)分）和 ECs（由消化酶和代謝相關(guān)基因標(biāo)記和區(qū)分）的存在和分化路徑（圖 4C）。

已知一些果蠅中腸細(xì)胞類型占據(jù)不同的空間位置以執(zhí)行其功能。例如，銅細(xì)胞專門位于中腸中部的小段中。為了探索中腸細(xì)胞亞簇的空間模式，我們通過從 scRNA-seq 到胚胎 scStereo-seq 數(shù)據(jù)的標(biāo)簽轉(zhuǎn)移，將上述識(shí)別的亞簇映射到它們各自的空間位置（圖 4D）。正如預(yù)期的那樣，胃盲囊和銅細(xì)胞表現(xiàn)出高度的空間聚集（圖 4D）。在標(biāo)簽轉(zhuǎn)移的 scStereo-seq 3D 模型中，我們觀察到了整個(gè)胚胎發(fā)生過程中細(xì)胞類型比例的動(dòng)態(tài)變化，反映了這些細(xì)胞類型出現(xiàn)的時(shí)間不同。例如，EC（Try29F+）在大約 13 小時(shí)的發(fā)展中出現(xiàn)，而 EC（Acbp3+）直到大約 17 小時(shí)才形成（圖 4E）。鄰域富集分析表明，所有 EC 亞簇都表現(xiàn)出更高的聚集空間分布。在胚胎 scStereo-seq 樣本中，我們觀察到 Jon99Cii 和 Try29F 標(biāo)記的 ECs 占據(jù)不同的空間位置，這表明這些負(fù)責(zé)產(chǎn)生消化酶的 ECs 傾向于占據(jù)中腸道的更后部位置（圖 4F）。我們進(jìn)一步在 BDGP 原位數(shù)據(jù)庫(kù)中檢查了具有高鄰域富集分?jǐn)?shù)的細(xì)胞亞簇標(biāo)記基因的空間分布。

總結(jié)來說，我們對(duì)胚胎中腸中存在的各種細(xì)胞亞簇進(jìn)行了分類和檢查。我們的分析揭示了占據(jù)不同空間位置的 EC 亞簇，并追蹤了它們?cè)诎l(fā)育過程中的分布。

圖4

8. 幼蟲和蛹中腸細(xì)胞亞群的基因表達(dá)和空間布局
與胚胎相比，幼蟲中腸的大小顯著增長(zhǎng)，并且在發(fā)育過程中顯示出更多樣化的腸細(xì)胞類型（圖 4G ）。值得注意的是，不同的 ECs 沿著中腸的前后軸緊密聚集，正如它們分布的 3D 模型中所觀察到的。在成年中腸中，已經(jīng)確定 EEs 可以被分類為幾個(gè)亞簇，每個(gè)亞簇表達(dá)獨(dú)特的肽激素組合，并占據(jù)中腸長(zhǎng)度上的不同區(qū)域。類似地，在我們的幼蟲 scStereo-seq 數(shù)據(jù)中，EEs 也可以被分類為表達(dá)各種肽激素的亞簇。這些 EE 亞簇也顯示了不同的空間分布，類似于在成年中腸中觀察到的（圖 4H）。這些觀察結(jié)果表明，EEs 的空間模式可能在幼蟲中也會(huì)發(fā)生，類似于成年。

我們的蛹 scStereo-seq 樣本的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究中腸變態(tài)的調(diào)控提供了寶貴的資源。檢查蛹 scStereo-seq 樣本，我們觀察到蛹中腸分層為兩層，我們?cè)谑謩?dòng)注釋中將這兩層標(biāo)注為“中腸內(nèi)層”和“中腸外層”（圖 4I）。這些結(jié)構(gòu)在 P24 階段后退縮，并在 P72 階段重新出現(xiàn)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在變態(tài)過程中，部分 AMPs 定位于圍繞幼蟲中腸的上皮層，該層退化成一種稱為黃色體的結(jié)構(gòu)。蛹 scStereo-seq 樣本中觀察到的中腸結(jié)構(gòu)可能反映了這種分層。檢查這兩層的表達(dá)譜，我們觀察到中腸內(nèi)層群富集了金屬硫蛋白和鐵蛋白家族基因，而中腸外層群表達(dá)了多種抗菌通路基因（例如，DptA 和 Drsl2）。這些結(jié)果為中腸變態(tài)過程中基因調(diào)控的研究提供了線索。

總之，使用標(biāo)簽轉(zhuǎn)移輔助的空間映射和注釋揭示了空間上不同的幼蟲和蛹中腸細(xì)胞類型及其在發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化。

9. 中腸功能區(qū)的出現(xiàn)與空間分布
同時(shí)，區(qū)域的空間分布開始在同一時(shí)間點(diǎn)結(jié)晶，反映了成年中腸中觀察到的空間順序（從前到后為 R1 到 R5）（圖 4J）。這表明晚期胚胎中腸表現(xiàn)出與其成年對(duì)應(yīng)物相似的區(qū)域分隔。我們檢查了已識(shí)別的胚胎中腸區(qū)域的標(biāo)記基因的GO富集。例如，R1/R2 類區(qū)域在功能上富集于脂肪酸代謝；R3 類區(qū)域在功能上富集于離子運(yùn)輸和 pH 調(diào)節(jié)，這與該區(qū)域的酸性性質(zhì)一致；R5 類區(qū)域在功能上富集于金屬離子穩(wěn)態(tài)。這些功能與成年中腸區(qū)域中的對(duì)應(yīng)功能非常吻合。我們以類似的方式對(duì)幼蟲中腸區(qū)域進(jìn)行了分析。成功識(shí)別了對(duì)應(yīng)于 R1 到 R5 區(qū)域的模塊，這些模塊沿幼蟲中腸的前后軸依次排列（圖 4K）。在我們的 scStereo-seq 數(shù)據(jù)中，我們注意到雖然 AMPs（由 esg 表達(dá)標(biāo)記）分布在整個(gè)中腸中沒有空間聚集（圖 4L），但位于每個(gè)已識(shí)別區(qū)域的 AMPs 表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜（圖 4L）。這些發(fā)現(xiàn)表明，中腸干細(xì)胞的區(qū)域特異性發(fā)生在幼蟲階段。

總之，我們的 scStereo-seq 數(shù)據(jù)展示了胚胎和幼蟲中腸中的不同區(qū)域及其基因表達(dá)譜，這些譜決定了與成年人相似的局部亞器官功能。

10. 通過多模態(tài)分析鑒定exex作為銅細(xì)胞調(diào)節(jié)因子
為了尋找中腸發(fā)育過程中以前未表征的細(xì)胞類型特異性調(diào)節(jié)因子，我們追蹤了整合的 scRNA-seq/scATAC-seq 數(shù)據(jù)的內(nèi)胚層軌跡（圖 5A ）。我們首先在每個(gè)譜系內(nèi)進(jìn)行差異基序分析，以識(shí)別表現(xiàn)出細(xì)胞譜系特異性活性的 TFs。在早期中腸中，我們識(shí)別了多個(gè)與先前報(bào)道的調(diào)節(jié) AMP 和 EE 分化的 TFs 相對(duì)應(yīng)的基序，包括 ttk73 和 lola。在晚期中腸分化過程中，我們還識(shí)別了已知的中腸發(fā)育調(diào)節(jié) TFs，如 fkh75 和 cad76。

檢查中腸譜系時(shí)，我們注意到銅細(xì)胞從早期中腸原基分化為高度特化的譜系（圖 5A ）。我們觀察到分化后的銅細(xì)胞在胚胎發(fā)生約 10 小時(shí)出現(xiàn)（圖 4E）。這與從 BDGP 原位數(shù)據(jù)庫(kù)推斷的時(shí)間點(diǎn)一致，其中銅細(xì)胞標(biāo)記 Vha100-4 在胚胎發(fā)育第 13 階段（約 10 小時(shí)）后出現(xiàn)。為了進(jìn)一步追蹤銅細(xì)胞譜系回溯到中腸原基的起源，我們對(duì)中腸原基簇進(jìn)行了亞聚類，產(chǎn)生了 7 個(gè)細(xì)胞群，每個(gè)細(xì)胞群沿著分化軌跡注定發(fā)展為各種中腸細(xì)胞類型（圖 5B）。其中，亞簇 2 導(dǎo)致了銅細(xì)胞的發(fā)展，我們觀察到特異性轉(zhuǎn)錄表達(dá)和 lab 基序活性的提高。這些發(fā)現(xiàn)與先前的發(fā)現(xiàn)一致，即同源盒（Hox）TF lab 是果蠅中腸中銅細(xì)胞的一個(gè)已確立的特異性決定因子，對(duì)于銅細(xì)胞的特化和維持既必要又充分。為了評(píng)估這一假設(shè)，我們檢查了沿著譜系中與銅細(xì)胞差異基序相對(duì)應(yīng)的 HD TFs 的表達(dá)水平。其中，我們注意到 exex 在譜系起源處表現(xiàn)出顯著的高表達(dá)水平，在銅細(xì)胞分化后表達(dá)水平下降（圖 5C 和 5D）。這些觀察進(jìn)一步暗示 exex 在胚胎到幼蟲階段的銅細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮作用。
 

圖5

11. exex 通過調(diào)節(jié) kay 和 lab 的表達(dá)來維持對(duì)銅細(xì)胞的特化和穩(wěn)態(tài)
為了驗(yàn)證 exex 的功能，我們使用 lab-Gal4 驅(qū)動(dòng) UAS-exex-shRNA 和 UAS-GFPnls 報(bào)告基因的表達(dá)，進(jìn)行了銅細(xì)胞特異性敲低（KD）。檢查晚期胚胎，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照胚胎相比，exex KD 胚胎在銅細(xì)胞區(qū)域的 lab::GFP 信號(hào)較弱且較少（圖 5E）。一致地，我們觀察到 RNAi KD 導(dǎo)致 L3 中腸中 exex 表達(dá)和 lab::GFP 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖 5F-5H）。剩余的 lab::GFP 陽性細(xì)胞與對(duì)照中觀察到的典型大、扁平、球形銅細(xì)胞特征相比，表現(xiàn)出明顯較小的尺寸和異常形態(tài)（圖 5G）。

然后，我們檢查了 exex KD 是否影響了銅細(xì)胞的生理功能。銅細(xì)胞在飲食銅處理后，當(dāng)被紫外線激發(fā)時(shí)，會(huì)發(fā)出橙色自體熒光。這被認(rèn)為是金屬硫蛋白與銅細(xì)胞中積累的銅離子相互作用的結(jié)果。在用銅飲食處理的 exex KD L3 中，我們觀察到 lab::GFP 陽性細(xì)胞數(shù)量和同時(shí)表現(xiàn)出橙色熒光的 lab::GFP 陽性細(xì)胞比例顯著減少（圖 5I 和 5J）。這表明在 exex 缺乏時(shí)，銅細(xì)胞中的銅離子穩(wěn)態(tài)喪失。我們進(jìn)一步研究了在攜帶 exexKK30（exex 功能喪失等位基因）的銅飲食 L3 中銅細(xì)胞的表型。這種品系在我們手中是純合致死的。在雜合 L3 中，我們注意到銅依賴性自體熒光細(xì)胞的顯著丟失和形態(tài)改變（圖 5K 和 5L）�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了 exex 在銅細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

隨后，我們探索了 exex 調(diào)節(jié)銅細(xì)胞特化的潛在機(jī)制。我們注意到 kay 和 Jra 的基序活性在銅細(xì)胞中排名靠前。這兩種 TFs 是已知的中腸中 lab 表達(dá)的激活因子�？紤]到 exex 表達(dá)水平與 kay 和 lab 之間的時(shí)間不同步（圖 5D），exex 活性可能先于其他兩個(gè)在原初銅細(xì)胞中起作用。這一時(shí)間順序得到了在 kay 的 TSS 區(qū)域識(shí)別 exex 基序的支持。此外，exex KD 導(dǎo)致 kay 表達(dá)水平顯著降低。盡管在 Jra 的 TSS 區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn) exex 基序，但我們?nèi)匀蛔⒁獾较嗨扑�平的表達(dá)減少。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們觀察到 lab 表達(dá)的中度但顯著的減少（圖 5M）。

綜上所述，這些觀察強(qiáng)調(diào)了 exex 在調(diào)節(jié)果蠅中腸中銅細(xì)胞發(fā)育和銅穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié) kay 和 lab 的表達(dá)水平。

12. exex 和 lab 在銅細(xì)胞發(fā)育過程中的潛在調(diào)控
盡管 exex 和 lab 的表達(dá)水平顯示了時(shí)間序列，但它們的結(jié)合基序在銅細(xì)胞譜系中持續(xù)活躍。因此，我們探索了 exex 是否也和 lab 協(xié)同發(fā)揮調(diào)控功能。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，我們檢查了所有包含 lab 或 exex 基序的峰，發(fā)現(xiàn)同時(shí)包含這兩種 TF 基序的峰（雙重基序）與銅細(xì)胞標(biāo)記基因的重疊程度比僅包含 lab 或 exex 基序的峰（單一基序）更大。與這一觀察結(jié)果一致，由雙重基序調(diào)節(jié)的銅細(xì)胞標(biāo)記基因表現(xiàn)出比僅由 lab 基序調(diào)節(jié)的基因更高的染色質(zhì)可及性和表達(dá)水平（圖 5N）。

此外，我們使用 scStereo-seq 數(shù)據(jù)可視化了在銅細(xì)胞中由雙重或單一基序上調(diào)或下調(diào)的標(biāo)記基因的空間表達(dá)模式。我們觀察到，具有雙重基序的上調(diào)基因在發(fā)育過程中表現(xiàn)出空間聚集趨勢(shì)的增加，而具有單一基序的基因沒有表現(xiàn)出空間聚集模式（圖 5O 和 5P）。與具有單一基序的基因相比，具有雙重基序的基因在時(shí)間上與銅細(xì)胞的空間相關(guān)性逐漸增加和增強(qiáng)（圖 5P）。這些發(fā)現(xiàn)表明，由雙重基序調(diào)節(jié)的基因在發(fā)育過程中對(duì)銅細(xì)胞的特異性逐漸增強(qiáng)。

為了進(jìn)一步檢測(cè) exex 銅細(xì)胞特異性 KD 導(dǎo)致的全球變化，我們對(duì)銅細(xì)胞進(jìn)行了批量 RNA-seq。在 exex KD 和對(duì)照組之間檢測(cè)到的 415 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）中，我們觀察到有 107 個(gè)（25.8%）與銅細(xì)胞標(biāo)記基因重疊。在這些基因中，我們注意到具有雙重基序的失調(diào)基因數(shù)量比具有單一基序的基因更多（圖 5Q）。檢查代表性的雙重基序基因，包括金屬內(nèi)肽酶基因 Mmp2 和 CG6763，以及一個(gè)未表征的糖基轉(zhuǎn)移酶基因 CG10000，我們注意到在 exex KD 上的顯著表達(dá)失調(diào)（圖 5Q），這得到了 qPCR 的證實(shí)（圖 5R）。我們進(jìn)一步觀察到這些基因的銅細(xì)胞差異可及性（DA）峰中存在雙重基序。這些觀察結(jié)果表明，除了調(diào)節(jié) lab 表達(dá)外，exex 的功能可能還包括在銅細(xì)胞發(fā)育過程中作為 lab 的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子。

總之，通過體內(nèi)功能驗(yàn)證，我們確認(rèn)了 exex 在銅細(xì)胞發(fā)育調(diào)控中的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了我們的多組學(xué)數(shù)據(jù)在識(shí)別發(fā)育組織中的細(xì)胞類型水平調(diào)節(jié)因子方面的實(shí)用性。

導(dǎo)語
多細(xì)胞生物的發(fā)育是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，它受到無數(shù)基因和通路在空間和時(shí)間上的嚴(yán)格調(diào)控。在這里，我們介紹了 Flysta3D-v2，一個(gè)涵蓋模式生物果蠅從胚胎到蛹期發(fā)育全過程的全面多組學(xué)圖譜。我們的數(shù)據(jù)集包括 3D 單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞染色質(zhì)可及性信息。通過整合多模態(tài)數(shù)據(jù)，我們生成了整個(gè)有機(jī)體發(fā)展中連續(xù)的虛擬 3D 模型。我們進(jìn)一步構(gòu)建了組織發(fā)育軌跡，揭示了細(xì)胞類型分化的詳細(xì)特征。重點(diǎn)關(guān)注中腸，我們使用多組學(xué)數(shù)據(jù)分析確定了參與中腸細(xì)胞類型調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，并通過突變研究驗(yàn)證了 exex 是銅細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。這個(gè)廣泛的圖譜提供了一個(gè)豐富的資源，并作為系統(tǒng)平臺(tái)，用于研究具有超高通量時(shí)空分辨率的集成單細(xì)胞數(shù)據(jù)的果蠅發(fā)育。

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