細胞焦亡的研究方法和關(guān)鍵調(diào)控因子
瀏覽次數(shù)：813 發(fā)布日期：2025-9-25
來源：本站 僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負
1、細胞焦亡的概念
細胞焦亡（pyroptosis）是由炎性小體觸發(fā)的程序性細胞死亡，其典型表現(xiàn)為細胞持續(xù)脹大直至細胞膜破裂，釋放細胞內(nèi)容物并引發(fā)強烈炎癥反應(yīng)。這一過程的發(fā)生依賴炎性半胱天冬酶（caspase）與 GSDMs 蛋白家族：被激活的 caspase 會切割 GSDMs 蛋白，釋放其 N 端結(jié)構(gòu)域；該結(jié)構(gòu)域可結(jié)合膜脂并在細胞膜上形成孔洞，導(dǎo)致細胞滲透壓改變，最終使細胞脹大、細胞膜破裂。作為機體重要的天然免疫反應(yīng)，細胞焦亡在抵御病原體感染中扮演關(guān)鍵角色。
炎性小體是一類多蛋白構(gòu)成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，其核心功能是感知危險信號 —— 無論是宿主自身產(chǎn)生的內(nèi)源性危險信號，還是病原體入侵帶來的外源性危險信號。一旦檢測到這類信號，炎性小體便會在細胞質(zhì)中啟動組裝過程，進而推動細胞因子釋放、誘導(dǎo)細胞發(fā)生焦亡型死亡，并觸發(fā)炎癥反應(yīng)。目前已被明確發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要有 5 種，分別為 NLRP1 炎性小體、NLRP3 炎性小體、NLRC4 炎性小體、IPAF 炎性小體和 AIM2 炎性小體。
2、細胞焦亡的研究方法有哪些？
細胞焦亡的機制中 GSDMD 的切割，IL-1β 和 IL-18 前體的切割成熟和釋放是關(guān)鍵信號，因此證明所誘發(fā)的細胞死亡方式是否為細胞焦亡，需要幾個關(guān)鍵的實驗證據(jù)：
（1）形態(tài)學(xué)
- 借助掃描電鏡直觀觀察細胞形態(tài)，判斷是否出現(xiàn)細胞焦亡特有的腫脹、細胞膜穿孔等典型形態(tài)特征；
- 通過 TUNEL 染色檢測細胞內(nèi) DNA 片段化情況，輔助鑒別細胞死亡是否伴隨焦亡相關(guān)的核酸損傷特征；
- 采用免疫熒光染色技術(shù)（LabEx可提供檢測服務(wù)），針對 GSDMD 或 GSDME 蛋白進行標記，觀察其在細胞內(nèi)的表達定位，明確焦亡關(guān)鍵效應(yīng)蛋白的激活與分布狀態(tài)。
（2）焦亡相關(guān)蛋白檢測
- 采用 qPCR 技術(shù)或 Western Blot 技術(shù)，分別從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，檢測與細胞焦亡相關(guān)的基因或蛋白的表達量，以此判斷焦亡通路是否被激活，LabEx提供升級版wb=抗體芯片技術(shù)，可一次性檢測幾十個信號通路關(guān)鍵蛋白；
- 通過 ELISA 試劑盒特異性捕獲樣本中的 IL-1β、IL-18 等炎癥因子，定量檢測其水平變化，為細胞焦亡過程中炎癥反應(yīng)的激活提供直接依據(jù)，LabEx提供Luminex、MSD等多因子檢測技術(shù)，可在一份樣本中檢測十幾、幾十種關(guān)鍵因子指標；
- 利用 MTT 法或 CCK-8 法，通過檢測細胞對試劑的代謝活性，間接測定細胞活力，輔助判斷細胞是否因焦亡發(fā)生死亡及死亡程度。
3、細胞焦亡的關(guān)鍵調(diào)控分子有哪些？
（1）GSDMs
Gasdermins（GSDMs）蛋白是介導(dǎo)細胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，目前已知人類 GSDM 基因家族包含 6 個成員，分別為 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME 與 DFNB59。在這 6 個成員中，除 DFNB59 外，其余所有 GSDMs 蛋白均由兩個功能不同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：一是 C 末端抑制結(jié)構(gòu)域（Regulatory Domain, RD，簡稱 CT），二是 N 末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Pore-Forming Domain, PFD，簡稱 NT），其中 NT 結(jié)構(gòu)域具備細胞毒性。當 RD 結(jié)構(gòu)域被水解去除后，游離的 PFD 結(jié)構(gòu)域可與細胞膜上的脂質(zhì)組分結(jié)合，進而在細胞膜上形成孔洞，啟動細胞焦亡過程。
研究發(fā)現(xiàn)，GSDMs 家族各成員的激活方式及生物學(xué)功能各具特點：GSDMD 可被 caspase-1、caspase-4/5/11 激活，GSDME 由 caspase-3 激活，GSDMB 能被 caspase-3/6/7 激活。作為家族首個被鑒定的成員，GSDMA 的亞型 GSDMA3 表達時可上調(diào) caspase-3 水平，暗示其可能參與細胞凋亡過程；GSDMB 通過與 caspase-4 的 CRAD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合增強其活性，這可能是細胞焦亡的另一調(diào)控途徑；當前關(guān)于 GSDMC 的功能研究數(shù)據(jù)較少；GSDMD 的功能具有多樣性，除誘導(dǎo)細胞焦亡外，還可促進中性粒細胞外陷阱形成，并與膿毒癥的發(fā)生相關(guān)；GSDME 在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等癌癥組織中存在甲基化，提示其可能發(fā)揮腫瘤抑制作用；DFNB59 則主要與聽力損傷的發(fā)生有關(guān)。
現(xiàn)階段，GSDMs 家族中僅 GSDMD 誘導(dǎo)細胞焦亡的機制已明確，這也是公認的細胞焦亡經(jīng)典途徑。其具體過程為：當細菌、病毒等信號作用于細胞時，胞內(nèi)模式識別受體（NLR）識別信號后，通過接頭蛋白 ASC 與 caspase-1 前體結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物，激活 caspase-1；活化的 caspase-1 一方面切割 GSDMD 產(chǎn)生 GSDM-NT 活性肽段，誘導(dǎo)細胞膜穿孔、細胞破裂并釋放內(nèi)容物以觸發(fā)炎癥，另一方面切割 IL-1β、IL-18 前體生成活性形式，釋放后募集炎癥細胞擴大炎癥反應(yīng)。
但研究發(fā)現(xiàn)存在例外情況：巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞中，部分細胞在炎性小體激活導(dǎo)致 GSDMD 裂解后，并未發(fā)生膜破裂與焦亡，反而能夠存活，這類細胞被定義為 “超活化細胞”。由于超活化細胞可分泌更多炎性介質(zhì)，而乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量與細胞膜完整性相關(guān)（焦亡細胞膜破裂會釋放大量 LDH，超活化細胞則不會），因此可通過檢測細胞培養(yǎng)上清中 LDH 的水平，區(qū)分細胞是超活化狀態(tài)還是發(fā)生了焦亡。然而，當前對于 GSDMD 裂解后為何會分別引發(fā)焦亡或超活化的具體調(diào)控機制，尚未得出明確結(jié)論。
參考文獻：Channelling inflammation: gasdermins in physiology and disease. 2021 May;20(5):384-405.
（2）Caspase-1
作為 IL-1β 轉(zhuǎn)化酶（IL-1β converting enzyme），caspase-1 是由單核細胞合成的蛋白酶，其核心功能是介導(dǎo) 34kD 的 IL-1β 前體（pro-IL-1β）向 17kD 成熟 IL-1β 的剪切，且這一加工過程對 IL-1β 活性的發(fā)揮至關(guān)重要。具體表現(xiàn)為：不表達 caspase-1 的細胞系，在轉(zhuǎn)入 IL-1β 基因后僅能產(chǎn)生 pro-IL-1β，無法分泌有活性的成熟 IL-1β；而 caspase-1 特異性抑制劑可成功阻斷金黃色葡萄球菌刺激引起的 IL-1β 分泌。酶學(xué)特征方面，caspase-1 屬于半胱氨酸蛋白酶，活性中心含高活性巰基，對氧化劑敏感，但不會被絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制劑所抑制。
（3）NLRP3
炎癥小體是細胞內(nèi)的蛋白復(fù)合物，機體受刺激后，可在免疫細胞及非免疫細胞中出現(xiàn)。NOD 樣受體（NOD-like receptor，NLR）相關(guān)炎癥小體是人體固有免疫的重要組成部分，功能關(guān)鍵。NLR 家族的分類依據(jù)是炎癥小體氨基末端的結(jié)構(gòu)特征：含吡啶結(jié)構(gòu)域（PYD）或半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（CARD），據(jù)此可分為 NLRP、NLRC 等亞家族。而由 NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 3（NLRP3）構(gòu)成的炎癥小體，即為 NLRP3 炎癥小體。
NLRP3 炎癥小體的結(jié)構(gòu)由三部分核心組件構(gòu)成，分別是 NLRP3 蛋白、凋亡相關(guān)點樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，簡稱 ASC），以及前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1（pro-caspase-1）。
人類 NLRP3 轉(zhuǎn)錄基因 cias1 定位于 1q44 號染色體；ASC 蛋白由 N 端熱蛋白結(jié)構(gòu)域與 C 端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）構(gòu)成，其中 N 端可結(jié)合 NLRP3 受體蛋白，C 端能募集兩個 pro-caspase-1 分子。NLRP3 炎癥小體可被模式識別受體（PRR）激活，激活信號包括病原相關(guān)分子模式（PAMP）與危險相關(guān)分子模式（DAMP）。
經(jīng)典激活途徑中，NLRP3 在激酶 NEK7 作用下發(fā)生復(fù)合物分離，進而誘導(dǎo) caspase-1 自動激活，隨后在 NF-κB 參與下，proIL-1β 與 proIL-18 被切割激活；非經(jīng)典途徑則依賴 caspase-4、5、11，最終生成具生物活性的 IL-1β 與 IL-18。近期研究表明，兩種途徑中 GSDMD（gasdermin D）蛋白均起關(guān)鍵作用：它可誘導(dǎo)細胞膜穿孔，促進 IL-1β 與 IL-18 從胞質(zhì)釋放，同時也是細胞焦亡的核心蛋白。
