多重免疫組織化學(xué)mIHC實(shí)驗(yàn)操作流程和常見問題詳細(xì)解答

多重免疫組化 (mIHC)！額......和 mIHC 差不多的那個(gè)？是的，Buuuut！二者在具體實(shí)操中仍存在許多不同，嗯~就是那種~微妙的不同~讓我們一起來看看吧~

Section.01
什么是 mIHC？

多重免疫組織化學(xué) (Multiplex immunohistochemistry，mIHC)，也稱為酪氨酸信號(hào)放大技術(shù) (TSA)，通過在單個(gè)組織切片上同時(shí)染色多種免疫標(biāo)記物，增強(qiáng)了單個(gè)組織切片中可觀察到的信息量，因此可成為直接在腫瘤微環(huán)境中可視化細(xì)胞相互作用的有力工具^[1]。

mIHC 的原理
 
圖 1. 多重免疫熒光染色中酪胺信號(hào)放大 (TSA) 的機(jī)制^[3]。

mIHC 借助不同的熒光染料標(biāo)記，通過多輪染色實(shí)現(xiàn)組織或細(xì)胞的多靶點(diǎn)染色。利用二抗上帶有的 HRP 來催化加入體系的非活性熒光素，以生成活化的熒光底物�；罨�的熒光底物可與抗原的酪氨酸共價(jià)結(jié)合，將信號(hào)以共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)合到抗原上。這種分子結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號(hào)比傳統(tǒng)的免疫結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號(hào)維持時(shí)間更久。后續(xù)進(jìn)行抗修復(fù)洗去非共價(jià)結(jié)合的抗體，并暴露出抗原以進(jìn)行下一輪的結(jié)合。待所有抗體孵育結(jié)束且熒光素都結(jié)合好后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)^[2]

Section.02
mIHC 完整實(shí)驗(yàn)步驟
 
圖 2. 免疫組化（IHC）流程圖。

樣本制備

(1)取材：在采集動(dòng)物或人體的組織樣本時(shí)，需特別注意控制組織塊的體積，使其保持在適當(dāng)范圍內(nèi)，以確保固定液能夠均勻且完全地滲透至組織內(nèi)部。
(2) PBS /生理鹽水沖洗：去除組織樣本中帶有的血液或者其他可能影響固定效果的體液。
(3) 固定：用 10% 福爾馬林、甲醇、乙醇或者它們的混合液室溫固定 18-24 小時(shí)，需要確保組織樣本完全浸入固定液，避免出現(xiàn)未固定部分。
(4) 固定后處理：流水沖去固定液。

包埋

常用的包埋介質(zhì)包括石蠟、樹脂等。以石蠟為例。

(1) 脫水：酒精梯度脫水，用 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、無水乙醇 (I)、無水乙醇 (II) 分別浸泡 30-60 min，此時(shí)樣本會(huì)變得不透明。
(2) 透明：用透明劑 (如二甲苯) 浸泡兩次，每次 30 min 以去除酒精和其他溶劑。注意避免透明過度導(dǎo)致樣本變硬易碎。
(3) 浸蠟：將經(jīng)過透明處理的組織樣本浸入熔融石蠟中，置于恒溫箱內(nèi)進(jìn)行浸透，使石蠟充分而均勻地滲入組織內(nèi)部。
(4) 包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具，倒入熔化的石蠟。等待石蠟冷卻凝固，避免過度冷卻導(dǎo)致石蠟碎裂或組織變形。

切片

(1) 切片：將包埋后的組織樣本用切片機(jī)切成 4-5 μm 厚的薄片。
(2) 展片烤片：用細(xì)毛刷輕柔地將切片從切片刀上分離，隨后置于 40℃ 溫水中使其充分展平，最后在 60℃ 條件下烘烤 2 小時(shí)以增強(qiáng)切片附著力。

脫蠟復(fù)水

(1) 脫蠟：依次使用二甲苯 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 進(jìn)行梯度脫蠟，每缸浸泡 5 分鐘。徹底清除石蠟對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，任何殘留都將干擾抗原暴露及染色效果。
(2) 復(fù)水：采用梯度乙醇（100% 乙醇 Ⅰ、100% 乙醇 Ⅱ、95% 乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇）依次脫水，每級(jí)作用 5 分鐘；最后經(jīng)純化水浸洗 5 分鐘完成水化過程。注意需要避免干片，干片會(huì)導(dǎo)致非特異性抗體結(jié)合出現(xiàn)高背景。

抗原修復(fù)

通過抗原修復(fù)技術(shù)暴露被封閉的抗原表位，以增強(qiáng)抗體結(jié)合效率。熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)是最常用的方法，推薦使用以下修復(fù)緩沖液：檸檬酸鹽緩沖液 (pH 6.0)、EDTA 緩沖液 (pH 8.0) 或 Tris-EDTA 緩沖液 (pH 9.0)。其中，EDTA 和 Tris-EDTA 緩沖液可以在檸檬酸鹽緩沖液使用效果不好時(shí)使用，但需注意在高表達(dá)樣本中可能產(chǎn)生非特異性染色�？梢远鄧L試幾種修復(fù)方法以達(dá)到最佳染色效果。

(1) 微波熱修復(fù)：加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于微波爐中火 8 min，停火 7 min，轉(zhuǎn)小火 8 min；取出染色盒，冷卻至室溫。
(2) 水浴熱修復(fù)：加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于水浴鍋中 95℃ 恒溫 25-30 min (注意控制溫度避免沸騰，以防組織脫落)。將樣片與水共冷，不可驟冷避免快速降溫導(dǎo)致抗原表位構(gòu)象改變。
(3) 高壓熱修復(fù)：在染色盒中加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓后繼續(xù)加熱 5 min，關(guān)閉電源，10 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。
(4) 酶解修復(fù)：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸葪l件下進(jìn)行酶解 (通常為 37°C，20 min)。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進(jìn)行后續(xù)處理。修復(fù)后用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
 

圖 3. 水浴熱修復(fù)^[5]。

阻斷

(1) 阻斷：采用 3% H₂O₂ 溶液室溫避光孵育樣本 15 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，避免其對(duì)后續(xù) HRP 顯色系統(tǒng)的干擾。
(2) 洗滌：用 ddH₂O 清洗切片兩次，每次 5 min。用 PBS 在搖床上洗 1 遍，每次 5 min。

封閉

(1) 封閉：用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加封閉液，用封閉液 (5% BSA 或者血清) 室溫或者 37℃ 孵育 30 min。
(2) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。

一抗孵育

(1)一抗稀釋：選擇合適的一抗，并用稀釋液 (PBS、TBS 等) 稀釋一抗至合適的比例。
(2) 一抗孵育：使用移液器將稀釋后的一抗均勻覆蓋樣本區(qū)域，置于濕度平衡的孵育盒中，37℃ 恒溫孵育 90 分鐘以促進(jìn)抗原-抗體特異性結(jié)合。
(3) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。針對(duì)易脫片樣本，采用 37℃ 預(yù)溫的溫和洗脫緩沖液，輕柔洗滌 5-20 分鐘，以維持組織完整性同時(shí)有效去除非特異性結(jié)合。

二抗孵育

(1) 二抗稀釋：選擇合適的二抗，并用稀釋液 (PBS、TBS 等) 稀釋二抗至合適的比例。
(2) 二抗孵育：室溫孵育二抗 1 h，注意避光和干片。
(3) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。

TSA 染料孵育

(1) 稀釋 TSA：用 1×TSA buffer 以 1:50-1:200 稀釋 TSA 染料配置成工作液。染色液在室溫下避光保存，最長可保存 24 h。
(2) 在玻片上滴加 100 μL 染色工作液，浸沒樣本，室溫?fù)u床上孵育 5-10 min，注意避免干燥。
(3) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。

抗體脫落

步驟同上述抗原修復(fù)步驟，目的是洗去已孵育的抗體。

冰凍切片/細(xì)胞爬片/骨組織 (容易脫片) 建議滴加適量 37℃ 預(yù)熱至完全溶解的 mIHC 專用抗體洗脫液均勻覆蓋樣本，37℃ 放置  5-20 min，棄洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液均勻覆蓋樣本，37℃ 放置 5-20 min。

洗滌

ddH₂O 洗一次，PBS 浸片 2 min。

重復(fù)

封片或者繼續(xù)染色，可從步驟 "阻斷封閉" 開始。重復(fù)步驟包括阻斷內(nèi)源性過氧化物酶—封閉 — 一抗孵育 — 二抗孵育 — TSA 熒光染料染色 — 抗體洗脫。

核染和封片

滴加 DAPI 工作液到樣本上，室溫孵育 5 min，PBS 洗滌一次，用抗熒光淬滅封片劑封片。長期保存建議用透明指甲油對(duì)蓋玻片邊緣進(jìn)行密封。

鏡檢拍照

切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

Section.03
mIHC 注意事項(xiàng)

(1) 建議在進(jìn)行多重免疫染色前先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估各抗體的染色效能，優(yōu)先對(duì)染色信號(hào)較弱的靶抗原進(jìn)行標(biāo)記，再依次進(jìn)行其他抗原的染色。
(2) 染料充分溶解混勻，表達(dá)高的一抗搭配弱光，表達(dá)低的搭配強(qiáng)光。
(3) 組織所包含細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于 1,000 個(gè)。
(4) 沒有一種抗原修復(fù)緩沖液可以適用于所有抗原。不同的抗體可能需要不同的抗原修復(fù)方法和條件，因此需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和抗體特性選擇合適的抗原修復(fù)方法。
(5) 實(shí)驗(yàn)過程中注意保持濕潤狀態(tài)，避免干片，易引起高背景或者出現(xiàn)陰陽片。
(6) 福爾馬林固定的樣本，對(duì)于石蠟包埋樣本，應(yīng)確保組織塊完整性，無可見裂隙或結(jié)構(gòu)破損。組織芯片 (TMA) 蠟塊需保持包埋基質(zhì)完整，避免切割或封固缺陷。載玻片上的切片應(yīng)呈現(xiàn)連續(xù)完整的組織結(jié)構(gòu)，無折疊或碎裂現(xiàn)象。
(7) TSA 熒光染料工作液 = VF 熒光染料 + TSA buffer；推薦熒光染料和 TSA buffer 的稀釋比為 1:200；稀釋比例可以根據(jù)具體情況靈活調(diào)整優(yōu)化，最佳范圍為 1:50-1:400；一般建議若一抗孵育時(shí)間常溫 1 h-3 h 內(nèi)，建議稀釋比例 1:50-1:200，若一抗孵育時(shí)間 4℃ 過夜 (12 h 或以上)，建議稀釋比例 1:200-1:400 或更高。
(8) 使用幾種熒光素時(shí)，盡量選擇相互之間無光譜交叉的熒光素，降低標(biāo)記熒光強(qiáng)度，樣品的一種或幾種熒光強(qiáng)度太高，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致光譜交叉出現(xiàn)。采用降低標(biāo)記物濃度、縮短標(biāo)記時(shí)間及調(diào)整熒光素介質(zhì)等方法可降低樣品熒光強(qiáng)度。

Section.04
mIHC 常見問題

Q 多重染色試劑盒可以做細(xì)胞/細(xì)胞爬片樣本嗎？
A 可以的，但是每輪之間的修復(fù)建議換成抗體洗脫液。另外爬片不建議做五色以上，爬片多次修復(fù)會(huì)無信號(hào)反應(yīng)。

Q 試劑盒對(duì)一抗二抗種屬有要求嗎？
A 支持 IHC-P，選擇特異性高的一抗抗體。一抗種屬盡量遠(yuǎn)離實(shí)際樣本種屬，避免二抗帶來的非特異性。試劑盒內(nèi)有搭配二抗，可以根據(jù)二抗來選擇一抗的來源。多色的優(yōu)勢(shì)在于一二抗種屬無需特別要求，一抗根據(jù)樣本種屬選擇既可，二抗根據(jù)一抗選擇即可，多個(gè)抗體組合，種屬不會(huì)有影響。

Q 可以用同一來源的一抗進(jìn)行染色嗎？
A 可以的，TSA 的優(yōu)點(diǎn)之一就是可以用于同一來源的一抗進(jìn)行多重染色。

Q 是否可以用自己的二抗？
A 可以的，能夠?qū)��?yīng)自己的一抗的 HRP 二抗就可以。

Q 標(biāo)本切片有刀痕褶皺怎么辦？切片易脫片怎么辦？
A 切片有刀痕可換個(gè)刀口切片或者將蠟塊置于 -20℃ 冰凍一會(huì)在切。切片有皺褶，要求撈片的時(shí)候片子充分展片，可在臺(tái)燈下觀察，展片溫度控制在 40℃ 左右。切片容易脫片可將玻片用多聚賴氨酸處理，以增強(qiáng)粘附性。
 
圖 4. 切片出現(xiàn)刀痕、褶皺。

Q 脫蠟不全，組織出現(xiàn)異染現(xiàn)象怎么辦？
A 根據(jù)不同的室溫，調(diào)節(jié)脫蠟的時(shí)間，原則是要徹底，干凈。一般夏天室溫高，脫蠟時(shí)間不需要很多 3-5 min 即可。冬天室溫較低，脫蠟時(shí)間需要延長，10-20 min 或更長。

Q 如何降低非特異性染色？
A 縮短一抗/二抗孵育時(shí)間，稀釋抗體比例。多克隆一抗容易出現(xiàn)背景，可以用單克隆抗體。內(nèi)源性過氧化氫酶在肝臟和腎臟等組織含量較高，需要延長阻斷時(shí)間減少背景。非特異性組分和抗體結(jié)合，需要延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間。適當(dāng)增加 PBS 洗滌次數(shù)和時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中防止干片。

Q 熱修復(fù)每一輪都要做嗎？
A 第一次染抗體之前的叫做抗原修復(fù)，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識(shí)別到抗原。在染后面幾輪抗體之前的抗原修復(fù)，目的是為了去掉上一輪染色的抗體以及殘留沒有結(jié)合上的染料。如果是新鮮的冰切，可以不做抗原修復(fù)但仍需要阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。如果是固定組織的冰凍切片仍需要做抗原修復(fù)，但是冰凍切片加熱會(huì)有脫片風(fēng)險(xiǎn)，所以我們一般不建議固定樣本的客戶轉(zhuǎn)做冰切。另外冰切樣本可以用抗原洗脫液進(jìn)行處理。

Section.04
mIHC 技術(shù)服務(wù)

mIHC 產(chǎn)品推薦-多重?zé)晒鈾z測(cè)試劑盒
 












mIHC MCE 承接服務(wù)

• 提供有償代檢和分析服務(wù)
• 承接多色配套服務(wù)

​ ​圖 5. MCE 可提供的配套服務(wù)。

[1] Ross AB, et al. Proteome Turnover in the Spotlight: Approaches, Applications, and Perspectives. Mol Cell Proteomics. 2021;20:100016.
[2] Fornasiero EF, et al. Determining and interpreting protein lifetimes in mammalian tissues. Trends Biochem Sci. 2023 Feb;48(2):106-118. 
[3] Aria Kaiyuan Sun, et al. Exploring Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Techniques and Histopathology Image Analysis: Current Practice and Potential for Clinical Incorporation. Cancer Med. 2025 Jan 7;14(1):e70523.
[4] Wei Chang Colin Tan, et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020 Apr;40(4):135-153.
[5] Aria Kaiyuan Sun, et al. Exploring Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Techniques and Histopathology Image Analysis: Current Practice and Potential for Clinical Incorporation. Cancer Medicine. 07 January 2025.
[6] Meitham Amereh, et al. Immunohistochemistry (IHC) staining of in-vitro cancer cell-generated tumoroids. MethodsX. 2023 Jun 3:10:102242.
[5] Oscar Maiques, et al. Multiplex chromogenic immunohistochemistry to stain and analyze paraffin tissue sections from the mouse or human. ScienceDirect. December 2022, 101879.