蛋白質半衰期的監(jiān)測方案及常用方法環(huán)己酰亞胺(CHX)介紹
蛋白質？半衰期？
是的！你體內的蛋白質是有壽命滴~處于不斷合成與降解的動態(tài)平衡中。
本期，我們一起來看看蛋白質半衰期的監(jiān)測方案有哪些？
Section.01
蛋白質也有半衰期！
蛋白質的......半衰期？是的！這是一個通用術語。
在物理學中，半衰期 (Half-life) 是描述放射性核素衰變速率的一個基本概念，指放射性核素衰變至原有數量一半所需的時間。當然，這也是我們最熟知的。而在蛋白質穩(wěn)態(tài)中，蛋白質半衰期也是十分重要的！先看圖！
圖 1. 蛋白質半衰期示意圖[1]。
在所有細胞中，蛋白質不斷地合成和降解，這一動態(tài)過程稱為蛋白質周轉 (protein turnover)，以維持蛋白質穩(wěn)態(tài)。在此過程中，舊蛋白質降解為氨基酸，隨后通過細胞內蛋白質合成被新蛋白質取代[1][2]。
圖中的 T1/2 就是指蛋白質的半衰期 (Protein half-life) —— 即蛋白質降解一半所需的時間，是衡量蛋白質動態(tài)變化的重要指標，反映了蛋白質在細胞內的穩(wěn)定性[3]。一般來說，蛋白質的半衰期越短，說明其降解速度越快，蛋白質“壽命”也就越短；半衰期越長，降解速度則越慢，蛋白質“壽命”也就相對較長。
本期為大家介紹研究蛋白質降解的常用方法——環(huán)己酰亞胺 (CHX)。
Section.02
CHX 追蹤分析
環(huán)己酰亞胺
環(huán)己酰亞胺(Cycloheximide, CHX) 是一種真核生物蛋白質合成抑制劑，可以與真核細胞蛋白質合成過程中核糖體 60S 亞基的 E-位點結合，阻斷核糖體易位過程并阻止新蛋白質的合成，而細胞中已有的蛋白質逐漸降解，通過測定降解速率能檢測細胞中特定蛋白質的變化過程。
自 1947 年從 Streptomyces griseus 中被發(fā)現(xiàn)以來，CHX 廣泛用于真核生物蛋白質合成的抑制劑[4]。CHX 可阻斷蛋白質翻譯。隨后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法檢查目標蛋白質“追蹤”水平的降低情況�？梢酝ㄟ^同時監(jiān)測控制穩(wěn)定的內源性蛋白質 (例如，微管蛋白或肌動蛋白) 的豐度來標準化生成的降解曲線[5]。
圖 2. CHX 追蹤分析[5]。
作為蛋白質翻譯阻滯劑，CHX 操作簡便，無需使用放射性同位素，不需要考慮正在進行的蛋白質合成的影響，并且可以進行高通量篩選喔~
實驗驗證
- CHX 使用方法：用不同濃度的 CHX 處理細胞，處理不同時間點收集細胞進行 WB 實驗檢測蛋白質水平的變化
- 結果檢測：半衰期短的蛋白質降解速度快，半衰期長的蛋白質降解速度慢。因此在 WB 檢測中，前者條帶強度迅速減弱，后者條帶強度變化不明顯。
MCE 獨家驗證
為了檢測 HCT 116 細胞中 CHX (HY-12320) 對 MDM2、c-Myc 蛋白的穩(wěn)定性影響，利用 CHX 免疫印記分析 MDM2、c-Myc 蛋白穩(wěn)定性。結果表明，CHX 促進 MDM2、c-Myc 蛋白的降解，并且表現(xiàn)出不同批次間的一致性。
圖 3. CHX 抑制MDM2、c-Myc 蛋白的表達。
(A) 用HCT 116 細胞分別用 10 μg/mL 和 100 μg/mL 的 CHX 處理 0、2、4、6 和 8 小時，通過 Western blot 檢測 MDM2 和 c-Myc 的表達。(B) HCT 116 細胞用 10 μg/mL 的 CHX 處理 0、2、4 和 6 小時，通過 Western blot 檢測不批次間 MDM2 和 c-Myc 的表達。
CHX 追蹤案例
CHX 可用于測定不同條件下蛋白質穩(wěn)定性/半衰期的變化，例如敲除與野生型、過表達或敲低的情況。
以文獻研究為例，為了檢測 shCtrl 或 shAHI 1 轉染的 A549 細胞中 CHX 對 Tyk2 蛋白的穩(wěn)定性影響，利用環(huán)己酰亞胺 (CHX) 免疫印記分析 Tyk2 蛋白穩(wěn)定性[6]。
圖 4. CHX 追蹤測定的完整實驗程序[6]。結果表明，CHX 促進 Tyk2 蛋白的降解，而 AHI 1 缺陷顯著加速 A549 細胞中 Tyk 2 蛋白的降解。
圖 5. AHI 1 敲低加速 CHX 對 Tyk2 蛋白的降解[6]。(A) 用 shRNA (shCtrl) 或 shAHI 1 轉染的 A549 細胞中，轉染 72 小時后，用 DMSO 或環(huán)己酰亞胺（CHX，50 μg/mL）處理細胞 0, 6, 12 h，進行 Tyk 2 蛋白水平的蛋白質印跡分析。(B) 將 Tyk 2 和微管蛋白的條紋圖像導入 Image J。測量所有條帶的像素計數，然后在 GraphPad Prism 軟件中計算剩余 Tyk 2 的百分比。
注意事項
1. 蛋白質的降解速率可能存在很大差異，因此建議事先使用 CHX 追蹤實驗確定蛋白質降解的時間進程。一些內源性蛋白質降解非常迅速，因此 CHX 的處理時間可以調整為 30-60 min。有時只需設置五個時間點即可檢測蛋白質的半衰期。
2. 不同細胞系對 CHX 敏感度不同，檢測指標蛋白質之間的降解速率可能差異很大。在進行正式的實驗之前，建議參考文獻，提前做預實驗 (摸索 CHX 處理時間、濃度，抗體條件)，確定實驗方案合理可行。
3. 傳代次數、細胞狀態(tài)、細胞密度都可能會影響實驗效果。需要調整細胞狀態(tài)至較好時開展實驗。
4. CHX 具有細胞毒性，配制和使用過程中需在通風良好的環(huán)境中進行，注意防護。藥物現(xiàn)配現(xiàn)用，可超聲助溶，直至溶液澄清透明；應避光、低溫保存，避免其分解失效。
5. 對實驗結果進行量化分析，例如通過灰度值分析計算蛋白條帶的強度，以準確評估蛋白質的降解程度。分析數據時要考慮到實驗的重復性和統(tǒng)計學意義。
但另一方面，CHX 能夠非特異性地阻斷所有蛋白質翻譯；以及不適用于降解速度慢的蛋白質，因為其具有高細胞毒性，長時間處理后能夠導致大規(guī)模細胞死亡。因此，小伙伴們需要根據適當的條件選擇 CHX[6]。
Section.03
其他監(jiān)測方法
目前，除了 CHX 法，還有多種不同的方法來監(jiān)測蛋白質降解率和估計蛋白質半衰期，小 M 為大家整理在下方表格中，包括脈沖追蹤測定、質譜技術、CuAAC (銅催化疊氮化物-炔烴環(huán)加成物) 標記法[6][7][8][9]。
此外，可以通過向細胞中添加降解途徑的藥物抑制劑來研究蛋白質降解，例如，蛋白酶體抑制劑 MG-132，與 CHX 結合起來也能夠驗證蛋白質的穩(wěn)定性和降解。
"搭檔"MG132
MG132 (HY-13259) 是一種常用的蛋白酶體降解抑制劑，通過與 β 亞基的活性位點共價結合抑制 20S 蛋白酶體的活性，并有效阻斷 26S 蛋白酶體復合物的蛋白水解活性，使泛素化蛋白質在細胞內積累[10]。
CHX 追蹤案例
為了檢測 NSC34 運動神經元細胞中抑制蛋白酶體系統(tǒng)是否可以抵消 CHX 處理后的 a-SMN 快速降解。在存在或不存在 MG 132 的情況下，利用 CHX 免疫印記檢測 FL-SMN 和 a-SMN 蛋白的穩(wěn)定性。結果表明，CHX 促進 FL-SMN 和 a-SMN 蛋白的降解，而 MG 132 延長了 FL-SMN 和 a-SMN 蛋白的半衰期。
圖 6. MG132 增加了 FL-SMN 和 a-SMN 蛋白的穩(wěn)定性[11]。(A) 存在或 (B) 不存在 MG 132 的情況下，用 N-末端標記的人 FL-SMN 和 a -SMN 共轉染 NSC 34 細胞，然后用 100 μg/mL CHX 處理 0、1、3、5 和 7 小時，通過 Western blot 檢測 FL-SMN 和 α-SMN 的表達。(w/o MG132: without MG132；a-SMN：較短的 SMN 亞型)
當然，還有環(huán)氧霉素和硼替佐米通過泛素-蛋白酶體途徑阻斷蛋白質降解。氯喹和 bafilomycin A1 等抑制劑通過中和溶酶體內的酸性 pH 值發(fā)揮作用[6]。
Section.04
小結
CHX 作為蛋白質合成抑制劑，在測量蛋白質半衰期的實驗中發(fā)揮著重要作用。但在實際應用中，需要綜合考慮其優(yōu)缺點哦~合理選擇和運用 CHX 測量方法，以獲取準確可靠的蛋白質半衰期數據，為深入研究蛋白質的功能和調控機制提供有力支持！
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Cycloheximide (CHX) (HY-12320) 環(huán)己酰亞胺，真核生物蛋白質合成抑制劑 |
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可用于人、猴背景下的 WB、ICC/IF、IHC-P 實驗 |
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用于人、小鼠、大鼠背景下 WB、ICC/IF、IP 實驗 |
[1] Ross AB, et al. Proteome Turnover in the Spotlight: Approaches, Applications, and Perspectives. Mol Cell Proteomics. 2021;20:100016.
[2] Fornasiero EF, et al. Determining and interpreting protein lifetimes in mammalian tissues. Trends Biochem Sci. 2023 Feb;48(2):106-118.
[3] Ghosh R, et al. Protein and Mitochondria Quality Control Mechanisms and Cardiac Aging. Cells. 2020 Apr 10;9(4):933.
[4] Zhang B, et al. Overproduction of lactimidomycin by cross-overexpression of genes encoding Streptomyces antibiotic regulatory proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Mar;100(5):2267-77.
