炎癥小體NLRP3的結構、激活途徑及WB常見問題原因分析
引言
炎癥反應（inflammation）是細胞對微生物感染、外界刺激以及自身組織損傷做出的復雜生物學反應，包括疼痛，發(fā)熱，發(fā)紅，發(fā)腫以及組織功能受損等一系列癥狀。
如果你要深入研究驗證，那一定繞不開炎癥小體。
大部分炎癥小體的基礎結構都是以NLR或ALR蛋白家族作為受體蛋白(receptor)、ASC作為接頭蛋白(adaptor)、caspase作為效應蛋白(effector)。
炎癥小體結構示意圖
目前研究較多的是NLRP3炎癥小體。
NLRP3炎癥小體由ASC、Caspase-1和NLRP3組成。NLRP3炎癥小體蛋白質結構可表示為：LRR-NACHT-PYD : PYD-CARD : CARD-Caspase。
在研究檢測NLRP3時，我們需要提前做好哪些功課，避開雷區(qū)，比較快的得到正確客觀的結果呢？小優(yōu)整理了以下三點
01 NLRP3激活途徑
NLRP3的典型途徑 — 炎癥小體激活
炎癥小體激活經典途徑描述了巨噬細胞中 NLRP3 的激活，其中需要兩種刺激。
在靜息狀態(tài)下，NLRP3 和 IL-1β 在細胞中表達量處于極低水平，不能用于組裝或活化 NLRP3 炎癥小體。
免疫細胞需要接受引發(fā)刺激，如脂多糖（LPS）與胞膜上的Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）結合以激活NF-κB，活化的NF-κB進一步上調NLRP3、pro-IL-1β的mRNA轉錄水平。
高水平的NLRP3、pro-IL-1β mRNA是形成有效炎癥小體的關鍵，所以我們在碰到WB無條帶的時候，也可以通過mRNA來確定NLRP3、pro-IL-1β的表達量。
接受啟動信號后,NLRP3炎癥小體會因病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)等多種因素而被激活。
NLRP3結構蛋白的寡聚化作用使其與接頭蛋白ASC的PYD相結合，然后ASC的CARD與pro-Caspase-1上的CARD結合，形成完整且有活性的NLRP3炎性小體，促使pro-Caspase-1自我裂解，產生活性的效應蛋白Caspase-1。
Caspase-1具有剪切GSDMD的功能，使GSDMD的N末端結構域釋放。N-GSDMD通過與細胞膜上內頁的磷脂酰絲氨酸和磷酸肌醇結合，在細胞膜上打孔，細胞內外失衡而破裂，引起細胞死亡，細胞內容物釋放到細胞外，引起炎癥反應。
Caspase除了剪切GSDMD，還可以誘導IL-1β和IL-18從未成熟狀態(tài)轉化為活性狀態(tài)，細胞死亡后IL-1β和IL-18會釋放到細胞外從而誘發(fā)神經炎癥。
ASC、caspase-1的剪切，IL-1β和IL-18的剪切，以及GSDMD的剪切，這些結果都可以幫助我們判斷NLRP3炎癥小體的激活情況。
doi: 10.1038/s41419-021-03751-3.
以這篇文獻為例，作者通過對腎小管上皮細胞HK-2進行H/R 模型研究，得出結論：氧化應激上調的 FIP1 通過誘導 3'UTR 縮短來放大炎癥、纖維化、ROS 產生和細胞凋亡。
FIP1 促進腎小管上皮細胞的炎癥（文獻 Fig 5）
02 NLRP3激活途徑
前面我們提到NLRP3在靜息細胞中表達量很低，那是不是未刺激的細胞就無法檢測到WB條帶呢？答案是否定的。
從HPA（The Human protein Atlas）可知NLRP3在血液和免疫細胞中的基因表達水平尚可，富集于巨噬細胞、庫普弗細胞、霍夫鮑爾細胞，但NLRP3多以泛素化無活性、穩(wěn)定狀態(tài)存在，實際蛋白水平并不高。
NLRP3在人源細胞系中的基因表達水平（HPA）
從BioGPS可知NLRP3在鼠源細胞系中主要在血液和免疫細胞上表達，并可通過適當的刺激處理（如LPS）提高其表達量。
NLRP3在鼠源細胞系中的基因表達水平（BioGPS）
NLRP3在樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞中的表達較高水平，樣本選擇時首先需要了解它的表達情況。若蛋白本身不表達或表達量極低，刺激處理也未必能有效提高表達水平，如何才能有效激活也需要多參考文獻中的條件設置。
不同樣本及不同處理NLRP3的蛋白表達情況
03 WB常見問題的優(yōu)化方案
在做Western實驗時，有的老師可能會遇到無條帶、非特異帶、高背景或者條帶位置不對的情況，針對這些情況出現的可能原因，小優(yōu)進行了一一分析，并給出了相應的解決方案。
QUESTION
常見問題原因分析
NO.1 無條帶：
樣品未經合適處理；提取不充分；抗體不工作
NO.2 非特異帶：
樣品降解；漂洗不充分；抗體非特異
NO.3 高背景：
樣品降解；試劑或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗體非特異
NO.4 條帶位置不對：
樣品降解，膠濃度，抗體非特異
小優(yōu)細節(jié)君：如何才能得到一個漂亮的結果呢？小優(yōu)為您提供了一些優(yōu)化建議：
01無條帶
設置陽性對照（如小鼠骨髓源性的DC、骨髓源性的巨噬細胞等）；樣品新鮮制備；裂解時建議超聲處理；增加上樣量(細胞20μg，組織50-100μg)；更換抗體。
02非特異性條帶
新鮮制備樣品；加強漂洗，增加漂洗液中的NaCl 濃度（150mM-500mM）和Tween濃度（0.1-0.5%）；更換抗體。
03高背景
新鮮制備樣品；實驗中試劑包括電泳液、轉膜液、漂洗液、脫脂奶粉、抗體稀釋液等用新鮮配制的，使用干凈的海綿、新的濾紙，操作時用鑷子夾邊緣不要用手觸摸，孵育時放平、均勻孵育，保持膜的濕潤；加強漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween濃度；換用NC膜；更換抗體。
04條帶位置不對
新鮮制備樣品；使用梯度膠，排查問題時孵全膜；更換抗體。
小優(yōu)Tips
裂解后對細胞或組織進行超聲，目的在于確保膜的充分剪切，并通過斷裂染色質，提高蛋白的可溶性，幫助徹底裂解樣本，減少拖帶。
超聲步驟為冰上3 X 5 second bursts at 50% output。如沒有超聲儀，可用1ml注射器針頭，冰上反復抽打裂解液10次左右，達到類似于超聲的效果。
裂解物超聲效果
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炎癥反應（inflammation）是細胞對微生物感染、外界刺激以及自身組織損傷做出的復雜生物學反應，包括疼痛，發(fā)熱，發(fā)紅，發(fā)腫以及組織功能受損等一系列癥狀。
如果你要深入研究驗證，那一定繞不開炎癥小體。
大部分炎癥小體的基礎結構都是以NLR或ALR蛋白家族作為受體蛋白(receptor)、ASC作為接頭蛋白(adaptor)、caspase作為效應蛋白(effector)。
炎癥小體結構示意圖
目前研究較多的是NLRP3炎癥小體。
NLRP3炎癥小體由ASC、Caspase-1和NLRP3組成。NLRP3炎癥小體蛋白質結構可表示為：LRR-NACHT-PYD : PYD-CARD : CARD-Caspase。
在研究檢測NLRP3時，我們需要提前做好哪些功課，避開雷區(qū)，比較快的得到正確客觀的結果呢？小優(yōu)整理了以下三點
01 NLRP3激活途徑
NLRP3的典型途徑 — 炎癥小體激活
炎癥小體激活經典途徑描述了巨噬細胞中 NLRP3 的激活，其中需要兩種刺激。
在靜息狀態(tài)下，NLRP3 和 IL-1β 在細胞中表達量處于極低水平，不能用于組裝或活化 NLRP3 炎癥小體。
免疫細胞需要接受引發(fā)刺激，如脂多糖（LPS）與胞膜上的Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）結合以激活NF-κB，活化的NF-κB進一步上調NLRP3、pro-IL-1β的mRNA轉錄水平。
高水平的NLRP3、pro-IL-1β mRNA是形成有效炎癥小體的關鍵，所以我們在碰到WB無條帶的時候，也可以通過mRNA來確定NLRP3、pro-IL-1β的表達量。
接受啟動信號后,NLRP3炎癥小體會因病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)等多種因素而被激活。
NLRP3結構蛋白的寡聚化作用使其與接頭蛋白ASC的PYD相結合，然后ASC的CARD與pro-Caspase-1上的CARD結合，形成完整且有活性的NLRP3炎性小體，促使pro-Caspase-1自我裂解，產生活性的效應蛋白Caspase-1。
Caspase-1具有剪切GSDMD的功能，使GSDMD的N末端結構域釋放。N-GSDMD通過與細胞膜上內頁的磷脂酰絲氨酸和磷酸肌醇結合，在細胞膜上打孔，細胞內外失衡而破裂，引起細胞死亡，細胞內容物釋放到細胞外，引起炎癥反應。
Caspase除了剪切GSDMD，還可以誘導IL-1β和IL-18從未成熟狀態(tài)轉化為活性狀態(tài)，細胞死亡后IL-1β和IL-18會釋放到細胞外從而誘發(fā)神經炎癥。
ASC、caspase-1的剪切，IL-1β和IL-18的剪切，以及GSDMD的剪切，這些結果都可以幫助我們判斷NLRP3炎癥小體的激活情況。
以這篇文獻為例，作者通過對腎小管上皮細胞HK-2進行H/R 模型研究，得出結論：氧化應激上調的 FIP1 通過誘導 3'UTR 縮短來放大炎癥、纖維化、ROS 產生和細胞凋亡。
FIP1 促進腎小管上皮細胞的炎癥（文獻 Fig 5）
02 NLRP3激活途徑
前面我們提到NLRP3在靜息細胞中表達量很低，那是不是未刺激的細胞就無法檢測到WB條帶呢？答案是否定的。
從HPA（The Human protein Atlas）可知NLRP3在血液和免疫細胞中的基因表達水平尚可，富集于巨噬細胞、庫普弗細胞、霍夫鮑爾細胞，但NLRP3多以泛素化無活性、穩(wěn)定狀態(tài)存在，實際蛋白水平并不高。
從BioGPS可知NLRP3在鼠源細胞系中主要在血液和免疫細胞上表達，并可通過適當的刺激處理（如LPS）提高其表達量。
NLRP3在鼠源細胞系中的基因表達水平（BioGPS）
NLRP3在樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞中的表達較高水平，樣本選擇時首先需要了解它的表達情況。若蛋白本身不表達或表達量極低，刺激處理也未必能有效提高表達水平，如何才能有效激活也需要多參考文獻中的條件設置。
03 WB常見問題的優(yōu)化方案
在做Western實驗時，有的老師可能會遇到無條帶、非特異帶、高背景或者條帶位置不對的情況，針對這些情況出現的可能原因，小優(yōu)進行了一一分析，并給出了相應的解決方案。
QUESTION
常見問題原因分析
NO.1 無條帶：
樣品未經合適處理；提取不充分；抗體不工作
樣品降解；漂洗不充分；抗體非特異
樣品降解；試劑或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗體非特異
樣品降解，膠濃度，抗體非特異
小優(yōu)細節(jié)君：如何才能得到一個漂亮的結果呢？小優(yōu)為您提供了一些優(yōu)化建議：
01無條帶
設置陽性對照（如小鼠骨髓源性的DC、骨髓源性的巨噬細胞等）；樣品新鮮制備；裂解時建議超聲處理；增加上樣量(細胞20μg，組織50-100μg)；更換抗體。
02非特異性條帶
新鮮制備樣品；加強漂洗，增加漂洗液中的NaCl 濃度（150mM-500mM）和Tween濃度（0.1-0.5%）；更換抗體。
03高背景
新鮮制備樣品；實驗中試劑包括電泳液、轉膜液、漂洗液、脫脂奶粉、抗體稀釋液等用新鮮配制的，使用干凈的海綿、新的濾紙，操作時用鑷子夾邊緣不要用手觸摸，孵育時放平、均勻孵育，保持膜的濕潤；加強漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween濃度；換用NC膜；更換抗體。
04條帶位置不對
新鮮制備樣品；使用梯度膠，排查問題時孵全膜；更換抗體。
小優(yōu)Tips
裂解后對細胞或組織進行超聲，目的在于確保膜的充分剪切，并通過斷裂染色質，提高蛋白的可溶性，幫助徹底裂解樣本，減少拖帶。
超聲步驟為冰上3 X 5 second bursts at 50% output。如沒有超聲儀，可用1ml注射器針頭，冰上反復抽打裂解液10次左右，達到類似于超聲的效果。
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貨號 |
靶點 |
產品名稱 |
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NLRP3 |
NLRP3 (D4D8T) Rabbit mAb |
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AIM2 |
AIM2 (D5X7K) Rabbit mAb |
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NLRC4 |
NLRC4 (D5Y8E) Rabbit mAb |
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3866S |
Caspase-1 |
Caspase-1 (D7F10) Rabbit mAb |
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ASC/TMS1 |
ASC/TMS1 (E1E3I) Rabbit mAb |
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Cleaved Caspase-1 |
Cleaved Caspase-1 (Asp297) (D57A2) Rabbit mAb |
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Cleaved-IL-1β |
Cleaved-IL-1β (Asp116) (D3A3Z) Rabbit mAb |
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IL-1β |
IL-1β (D3U3E) Rabbit mAb |
參考文獻：
- Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases
- The NLRP3–inflammasome as a sensor of organelle dysfunction
- The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics
- Inflammasomes and Their Roles in Health and Disease
- Alternative polyadenylation trans-factor FIP1 exacerbates UUO/IRI-induced kidney injury and contributes to AKI-CKD transition via ROS-NLRP3 axis
- https://www.proteinatlas.org/ENSG00000162711-NLRP3/celltype
- http://biogps.org/#goto=genereport&id=216799
