中國(guó)科學(xué)家通過(guò)群體DNA甲基化多態(tài)性分析揭示表觀遺傳育種中的潛力
近日，浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院方磊教授和張?zhí)煺娼淌?/strong>、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所谷曉峰研究員、阿里巴巴達(dá)摩院（湖畔實(shí)驗(yàn)室）顧斐博士團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)對(duì)207份棉花材料開花后20天（DPA）纖維進(jìn)行單堿基DNA甲基化測(cè)序（WGBS）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）和全基因組測(cè)序（WGS），利用GWAS、eQTL、EWAS、eQTM、深度學(xué)習(xí)模型DeepFDML等算法，將群體遺傳學(xué)的經(jīng)典框架擴(kuò)展到表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。研究揭示了DNA甲基化多態(tài)性（SMPs）與基因表達(dá)和纖維性狀的關(guān)聯(lián)，并證明了DNA甲基化數(shù)據(jù)在作物育種中的重要應(yīng)用價(jià)值。相關(guān)研究成果以“Population-wide DNA Methylation Polymorphisms at Single-nucleotide Resolution in 207 Cotton Accessions Reveal Epigenomic Contributions to Complex Traits”為題發(fā)表在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《Cell Research》。
標(biāo)題：Population-wide DNA Methylation Polymorphisms at Single-nucleotide Resolution in 207 Cotton Accessions Reveal Epigenomic Contributions to Complex Traits（207份棉花的群體DNA甲基化多態(tài)性揭示了表觀基因組對(duì)復(fù)雜性狀的貢獻(xiàn)）
發(fā)表時(shí)間：2024年10月17日
發(fā)表期刊：Cell Research
影響因子：IF 25.9/Q1
作者單位：浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院
組學(xué)技術(shù)：WGBS、RNA-seq、WGS（易基因金牌技術(shù)）
分析算法： eQTL、eQTM、DeepFDML等
DOI: 10.1038/s41422-024-01027-x
DNA甲基化在作物發(fā)育中發(fā)揮多種調(diào)控作用，但自然作物群體甲基化多態(tài)性與遺傳多態(tài)性、基因表達(dá)和表型變異之間的關(guān)系仍不清楚。本研究對(duì)207份棉花材料開花后20天（DPA）纖維的單堿基DNA甲基化組（methylomes）、轉(zhuǎn)錄組（transcriptomes）和基因組（genomes）進(jìn)行了整合分析，并將群體遺傳學(xué)的經(jīng)典框架擴(kuò)展到表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。研究共鑒定出超過(guò)2.87億個(gè)單甲基化多態(tài)性（SMPs），這一數(shù)量是單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的100倍。這些SMPs顯著富集在基因內(nèi)區(qū)域，而在轉(zhuǎn)座元件中則相對(duì)缺失。關(guān)聯(lián)分析進(jìn)一步鑒定出總計(jì)5,426,782個(gè)順式甲基化數(shù)量性狀位點(diǎn)（cis-meQTLs）、5,078個(gè)順式表達(dá)數(shù)量性狀甲基化（cis-eQTMs）和9,157個(gè)表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（eQTLs）。其中36.39%的順式eQTM基因與遺傳變異無(wú)關(guān)，表明許多與基因表達(dá)變異相關(guān)的SMPs不依賴于SNPs。
在與產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的1,715個(gè)表觀遺傳位點(diǎn)中，僅有36個(gè)（2.10%）與全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）位點(diǎn)一致。多組學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建揭示了可能43個(gè)參與纖維發(fā)育的cis-eQTMs基因，這些基因無(wú)法僅靠GWAS分析鑒定。在這些基因中，通過(guò)基因編輯成功驗(yàn)證了編碼CBL互作蛋白激酶10的基因在纖維長(zhǎng)度調(diào)控中的作用�？傊狙芯拷Y(jié)果表明，DNA甲基化數(shù)據(jù)可以作為育種的額外資源，并為加強(qiáng)和加速作物改良進(jìn)程提供機(jī)會(huì)。
研究方法
（1）DNA甲基化變異圖譜的構(gòu)建與表征
研究人員對(duì)207份核心種質(zhì)陸地棉群體（CUCP1）的20天開花后（20-DPA）的纖維進(jìn)行了全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），以構(gòu)建單堿基DNA甲基化變異圖譜。所有樣本的甲基化組數(shù)據(jù)均比對(duì)到棉花參考基因組TM-1 v2.1，平均比對(duì)率為74.90%±3.55%。每個(gè)測(cè)序的甲基化組平均覆蓋深度＞15X。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理和質(zhì)控，研究人員在CG、CHG和CHH三種甲基化背景下分別定量了62.32M、66.06M和4.3301M甲基化胞嘧啶。
棉花基因組的DNA甲基化水平較高，尤其是在異染色質(zhì)區(qū)域。全基因組范圍內(nèi)，CG、CHG和CHH位點(diǎn)的DNA甲基化水平分別為72%、55%和11%。研究還發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化變異在基因內(nèi)區(qū)域顯著富集，而在轉(zhuǎn)座元件（TEs）中則相對(duì)缺失。此外，研究人員定義了單甲基化多態(tài)性（SMPs），并基于SMPs進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，將207份材料分為四個(gè)分支。這些結(jié)果表明，DNA甲基化是棉花基因組中一個(gè)重要的變異來(lái)源，且在基因內(nèi)區(qū)域具有較高的變異頻率。
b.不同材料間DNA甲基化多樣性的基因組區(qū)域示例。
c.三維圖展示不同材料的DNA甲基化多樣性。
d.三種不同DNA甲基化背景之間的相關(guān)性。
e.條形圖顯示MAF大于0.5的SMP的數(shù)量和比例。
f.密度圖展示CG、CHG、CHH-SMPs和SNPs的MAF分布。
g-h. 盒須圖展示不同基因組特征中CG位點(diǎn)的SMP（g）和SNP（h）的MAF分布。
i. 不同DNA甲基化背景之間的連鎖不平衡（LD）衰減比較（垂直軸：LD水平；水平軸：成對(duì)距離）。
（2）基因富集區(qū)域的遺傳變異對(duì)甲基化組的顯著影響
研究人員進(jìn)一步分析了遺傳變異對(duì)DNA甲基化的作用。通過(guò)全基因組隨機(jī)抽樣，研究人員在CG、CHG和CHH三種甲基化背景下分別鑒定出119,685、37,831和24,683個(gè)甲基化數(shù)量性狀位點(diǎn)（meQTLs）。其中，順式meQTLs（cis-meQTLs）表現(xiàn)出更強(qiáng)的顯著性。研究人員對(duì)所有SMPs進(jìn)行了順式meQTL分析，共鑒定出5,426,782個(gè)順式meQTLs，包括940,794個(gè)CG-cis-meQTLs、883,280個(gè)CHG-cis-meQTLs和3,602,708個(gè)CHH-cis-meQTLs。這些順式meQTLs在基因組中的分布不均勻，特別是在染色體末端密度較高。此外，順式meQTLs在基因內(nèi)區(qū)域顯著富集，而在TEs中則顯著缺失。這些結(jié)果表明，基因富集區(qū)域的遺傳變異對(duì)DNA甲基化具有重要影響。
b.盒須圖顯示順式（cis-）和反式（trans-）meQTL的-log10(P) 分布。顯示中位數(shù)和四分位間距（IQR）。
c.UpsetR圖展示不同DNA甲基化背景下共有順式meQTLs比例。
d.DMR與顯著SNP之間的距離。
e.順式meQTL在全基因組范圍內(nèi)的分布。
f.順式meQTL在不同基因組特征中的富集和缺失情況。
（3）SMPs在表達(dá)調(diào)控中的作用
研究人員進(jìn)一步探討了DNA甲基化與基因表達(dá)之間的關(guān)系。通過(guò)eQTM分析，研究人員共鑒定出5078個(gè)順式eQTMs，涉及3505個(gè)蛋白編碼基因（PCGs）和1573個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）。這些eQTM基因在長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝、毛狀體分支和葡萄糖穩(wěn)態(tài)等過(guò)程中富集，可能與纖維發(fā)育相關(guān)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，CG甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中起著更為重要的作用。在順式eQTMs中，90%的eQTM基因與CG甲基化相關(guān)。這些結(jié)果表明，DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，尤其是CG甲基化。
b.在PCGs和lncRNAs中鑒定出的順式eQTMs數(shù)量。
c.受DNA甲基化調(diào)控的PCGs和lncRNAs比例。
d.重疊和特定的順式eQTM基因的UpsetR圖。右側(cè)：PCGs；左側(cè)：lncRNAs。
e.靠前SMPs與相關(guān)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。左側(cè)：PCGs；右側(cè)：lncRNAs。
f.高置信度eSNP-表達(dá)關(guān)聯(lián)散點(diǎn)圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)檢測(cè)到的eQTL。
g.順式和反式eQTLs數(shù)量的餅圖。
h.eQTM和meQTL分析中鑒定出的eQTM基因表征。這些位點(diǎn)被分為三組。遺傳和順式表觀遺傳調(diào)控（類型I）、遺傳和反式表觀遺傳調(diào)控（類型II）以及僅表觀遺傳調(diào)控（類型III）。
（4）表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（EWAS）揭示了大量與農(nóng)藝性狀相關(guān)的優(yōu)異表觀等位基因
研究人員利用SMPs進(jìn)行了表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（EWAS），鑒定出1715個(gè)與纖維產(chǎn)量和品質(zhì)性狀相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)。其中，1010個(gè)位點(diǎn)與產(chǎn)量相關(guān)性狀相關(guān)，705個(gè)位點(diǎn)與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)。這些表觀遺傳位點(diǎn)中，只有16個(gè)（0.93%）與GWAS位點(diǎn)重疊。例如，研究人員在A11染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與衣分（lint percentage, LP）相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于一個(gè)編碼核孔復(fù)合體相互作用組分（Nup93）的基因啟動(dòng)子區(qū)域。不同表觀等位基因?qū)?yīng)的LP值存在顯著差異。這些結(jié)果表明，DNA甲基化為農(nóng)藝性狀提供了額外的調(diào)控層，并且大多數(shù)表觀遺傳位點(diǎn)與遺傳變異獨(dú)立存在。
b.UpsetR圖展示CG-EWAS、CHG-EWAS和CHH-EWAS之間的重疊。
c.與小于2-kb和5-kb區(qū)域內(nèi)有側(cè)翼基因的EWAS位點(diǎn)比例。
d.EWAS分析LP性狀的曼哈頓圖。紅色箭頭表示在A11染色體上的信號(hào)。
e.放大圖顯示靠前SMP代表A11染色體上LP的EWAS位點(diǎn)，且信號(hào)坐標(biāo)位于同一甲基化不平衡塊中。
f.不同表觀等位基因的LP值，用于e中所示的位點(diǎn)。
g.根據(jù)CG-、CHG-和CHH-EWAS位點(diǎn)以及GWAS位點(diǎn)顯示自然種群中單倍型分布的熱圖。優(yōu)異等位基因用紅色表示。每一列代表一個(gè)材料，每一行指基因組中的一個(gè)位點(diǎn)。
h.對(duì)在EWAS和GWAS中鑒定出的位點(diǎn)表征描述。這些位點(diǎn)被分為四組。僅表觀遺傳調(diào)控（類型I）、僅遺傳調(diào)控（類型II）、遺傳/順式表觀遺傳調(diào)控（類型III）以及遺傳/反式表觀遺傳調(diào)控（類型IV）。
（5）通過(guò)多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析鑒定纖維相關(guān)基因
研究人員通過(guò)整合GWAS、eQTL和EWAS結(jié)果，構(gòu)建了纖維性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究人員發(fā)現(xiàn)，51個(gè)GWAS位點(diǎn)與376個(gè)eQTL在同一個(gè)連鎖不平衡（LD）塊內(nèi)共定位�；贚D塊分析，研究人員構(gòu)建了一個(gè)包含397個(gè)基因的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，研究人員還構(gòu)建了一個(gè)基于EWAS和eQTM的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)比較這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)，研究人員發(fā)現(xiàn)它們之間只有四個(gè)共有基因。這些結(jié)果表明，纖維性狀的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，涉及遺傳和表觀遺傳的多重調(diào)控。
b.調(diào)控棉花纖維性狀的基因網(wǎng)絡(luò)。右側(cè)：通過(guò)整合GWAS和eQTL構(gòu)建的遺傳變異依賴網(wǎng)絡(luò)；左側(cè)：通過(guò)整合EWAS和eQTM構(gòu)建的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
c.通過(guò)共定位分析確定的候選基因熱圖。
d.不同表觀等位基因中CIPK10的表達(dá)水平和LP值。
e.基因編輯（CRISPR敲除，CR-KO）對(duì)調(diào)控纖維性狀的eQTM基因GhCIPK10的性能的圖像。
f.兩條CIPK10CR-KO品系的纖維長(zhǎng)度。
（6）基于DNA序列使用DeepFDML預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)
研究人員開發(fā)了一個(gè)名為DeepFDML的深度學(xué)習(xí)模型，用于預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)。該模型基于2336個(gè)與基因表達(dá)變異相關(guān)的CG位點(diǎn)進(jìn)行訓(xùn)練。研究人員使用one-hot encoding將每個(gè)CG位點(diǎn)的側(cè)翼序列轉(zhuǎn)換為模型input。通過(guò)五折交叉驗(yàn)證，該模型的準(zhǔn)確率達(dá)到了0.65。研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)更復(fù)雜的DeepFDML模型，該模型采用了預(yù)訓(xùn)練的Enformer模型作為其主干網(wǎng)絡(luò)。該模型的接收者操作特征曲線（ROC）和精確召回曲線（PRC）分別達(dá)到了0.82和0.78，顯著優(yōu)于卷積模型。這些結(jié)果表明，基于DNA序列的深度學(xué)習(xí)模型可以有效預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)。
b.在整個(gè)數(shù)據(jù)集上測(cè)量的接收者操作特征（ROC）曲線。
c.在整個(gè)數(shù)據(jù)集上測(cè)量的精確率-召回率曲線（PRC）。
討論和啟示
本研究證明了DNA甲基化數(shù)據(jù)在作物育種中的重要應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)整合表觀組（DNA甲基化）、轉(zhuǎn)錄組、基因組的多組學(xué)數(shù)據(jù)，研究人員不僅發(fā)現(xiàn)了大量與纖維性狀相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)，還通過(guò)基因編輯技術(shù)驗(yàn)證了關(guān)鍵基因的功能。這些發(fā)現(xiàn)為棉花育種提供了新的策略，有助于加速作物改良進(jìn)程。
此外，研究人員開發(fā)的DeepFDML模型為預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)提供了一種新的方法，這將有助于未來(lái)在其他物種中進(jìn)行類似的研究。本研究強(qiáng)調(diào)了DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控和性狀改良中的重要作用，為表觀遺傳學(xué)在作物改良中的應(yīng)用提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：
Zhao, T., Guan, X., Hu, Y. et al. Population-wide DNA methylation polymorphisms at single-nucleotide resolution in 207 cotton accessions reveal epigenomic contributions to complex traits. Cell Res 34, 859–872 (2024). Doi:10.1038/s41422-024-01027-x
標(biāo)題：Population-wide DNA Methylation Polymorphisms at Single-nucleotide Resolution in 207 Cotton Accessions Reveal Epigenomic Contributions to Complex Traits（207份棉花的群體DNA甲基化多態(tài)性揭示了表觀基因組對(duì)復(fù)雜性狀的貢獻(xiàn)）
發(fā)表時(shí)間：2024年10月17日
發(fā)表期刊：Cell Research
影響因子：IF 25.9/Q1
作者單位：浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院
組學(xué)技術(shù)：WGBS、RNA-seq、WGS（易基因金牌技術(shù)）
分析算法： eQTL、eQTM、DeepFDML等
DOI: 10.1038/s41422-024-01027-x
DNA甲基化在作物發(fā)育中發(fā)揮多種調(diào)控作用，但自然作物群體甲基化多態(tài)性與遺傳多態(tài)性、基因表達(dá)和表型變異之間的關(guān)系仍不清楚。本研究對(duì)207份棉花材料開花后20天（DPA）纖維的單堿基DNA甲基化組（methylomes）、轉(zhuǎn)錄組（transcriptomes）和基因組（genomes）進(jìn)行了整合分析，并將群體遺傳學(xué)的經(jīng)典框架擴(kuò)展到表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。研究共鑒定出超過(guò)2.87億個(gè)單甲基化多態(tài)性（SMPs），這一數(shù)量是單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的100倍。這些SMPs顯著富集在基因內(nèi)區(qū)域，而在轉(zhuǎn)座元件中則相對(duì)缺失。關(guān)聯(lián)分析進(jìn)一步鑒定出總計(jì)5,426,782個(gè)順式甲基化數(shù)量性狀位點(diǎn)（cis-meQTLs）、5,078個(gè)順式表達(dá)數(shù)量性狀甲基化（cis-eQTMs）和9,157個(gè)表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（eQTLs）。其中36.39%的順式eQTM基因與遺傳變異無(wú)關(guān)，表明許多與基因表達(dá)變異相關(guān)的SMPs不依賴于SNPs。
在與產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的1,715個(gè)表觀遺傳位點(diǎn)中，僅有36個(gè)（2.10%）與全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）位點(diǎn)一致。多組學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建揭示了可能43個(gè)參與纖維發(fā)育的cis-eQTMs基因，這些基因無(wú)法僅靠GWAS分析鑒定。在這些基因中，通過(guò)基因編輯成功驗(yàn)證了編碼CBL互作蛋白激酶10的基因在纖維長(zhǎng)度調(diào)控中的作用�？傊狙芯拷Y(jié)果表明，DNA甲基化數(shù)據(jù)可以作為育種的額外資源，并為加強(qiáng)和加速作物改良進(jìn)程提供機(jī)會(huì)。
研究方法
- 植物材料：選取207份棉花材料，在開花后20天（20-DPA）時(shí)采集纖維樣本，這一時(shí)期是纖維發(fā)育的關(guān)鍵階段，特別是在次生細(xì)胞壁加厚過(guò)程中。
- 組學(xué)測(cè)序：采集20-DPA纖維樣本進(jìn)行WGBS、RNA-seq和WGS。WGBS計(jì)算甲基化水平和SMPs注釋。
- eQTM分析：使用fastQTL軟件進(jìn)行eQTM分析，研究DNA甲基化變異與基因表達(dá)的關(guān)系。
- cis-meQTLs分析：使用fastQTL軟件進(jìn)行cis-meQTLs分析，研究遺傳變異與DNA甲基化的關(guān)系。
- eQTLs分析：通過(guò)連鎖不平衡（LD）分析減少meQTLs的冗余性，并將關(guān)聯(lián)SNPs合并為一個(gè)meQTL。最終鑒定出的meQTLs進(jìn)一步分類為cis-eQTLs和trans-eQTLs。
- EWAS分析：鑒定與纖維性狀相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)。
- 植物材料、載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化：使用CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯，驗(yàn)證關(guān)鍵基因的功能。
- 表型預(yù)測(cè)：使用G2Pdeep和GBLUP方法進(jìn)行表型預(yù)測(cè)，評(píng)估模型性能。
- 基于深度學(xué)習(xí)的功能性CG甲基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)：開發(fā)DeepFDML模型，基于DNA序列預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)。
（1）DNA甲基化變異圖譜的構(gòu)建與表征
研究人員對(duì)207份核心種質(zhì)陸地棉群體（CUCP1）的20天開花后（20-DPA）的纖維進(jìn)行了全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），以構(gòu)建單堿基DNA甲基化變異圖譜。所有樣本的甲基化組數(shù)據(jù)均比對(duì)到棉花參考基因組TM-1 v2.1，平均比對(duì)率為74.90%±3.55%。每個(gè)測(cè)序的甲基化組平均覆蓋深度＞15X。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理和質(zhì)控，研究人員在CG、CHG和CHH三種甲基化背景下分別定量了62.32M、66.06M和4.3301M甲基化胞嘧啶。
棉花基因組的DNA甲基化水平較高，尤其是在異染色質(zhì)區(qū)域。全基因組范圍內(nèi)，CG、CHG和CHH位點(diǎn)的DNA甲基化水平分別為72%、55%和11%。研究還發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化變異在基因內(nèi)區(qū)域顯著富集，而在轉(zhuǎn)座元件（TEs）中則相對(duì)缺失。此外，研究人員定義了單甲基化多態(tài)性（SMPs），并基于SMPs進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，將207份材料分為四個(gè)分支。這些結(jié)果表明，DNA甲基化是棉花基因組中一個(gè)重要的變異來(lái)源，且在基因內(nèi)區(qū)域具有較高的變異頻率。
圖1：自然群體中DNA甲基化變異的廣泛模式。
a.多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析的工作流程。b.不同材料間DNA甲基化多樣性的基因組區(qū)域示例。
c.三維圖展示不同材料的DNA甲基化多樣性。
d.三種不同DNA甲基化背景之間的相關(guān)性。
e.條形圖顯示MAF大于0.5的SMP的數(shù)量和比例。
f.密度圖展示CG、CHG、CHH-SMPs和SNPs的MAF分布。
g-h. 盒須圖展示不同基因組特征中CG位點(diǎn)的SMP（g）和SNP（h）的MAF分布。
i. 不同DNA甲基化背景之間的連鎖不平衡（LD）衰減比較（垂直軸：LD水平；水平軸：成對(duì)距離）。
（2）基因富集區(qū)域的遺傳變異對(duì)甲基化組的顯著影響
研究人員進(jìn)一步分析了遺傳變異對(duì)DNA甲基化的作用。通過(guò)全基因組隨機(jī)抽樣，研究人員在CG、CHG和CHH三種甲基化背景下分別鑒定出119,685、37,831和24,683個(gè)甲基化數(shù)量性狀位點(diǎn)（meQTLs）。其中，順式meQTLs（cis-meQTLs）表現(xiàn)出更強(qiáng)的顯著性。研究人員對(duì)所有SMPs進(jìn)行了順式meQTL分析，共鑒定出5,426,782個(gè)順式meQTLs，包括940,794個(gè)CG-cis-meQTLs、883,280個(gè)CHG-cis-meQTLs和3,602,708個(gè)CHH-cis-meQTLs。這些順式meQTLs在基因組中的分布不均勻，特別是在染色體末端密度較高。此外，順式meQTLs在基因內(nèi)區(qū)域顯著富集，而在TEs中則顯著缺失。這些結(jié)果表明，基因富集區(qū)域的遺傳變異對(duì)DNA甲基化具有重要影響。
圖2：三種DNA甲基化背景的遺傳基礎(chǔ)。
a.SMP及其相關(guān)SNPs的基因組分布。x軸表示顯著SNPs的基因組位置，y軸表示相應(yīng)SMPs的基因組位置。選擇50,000個(gè)CG、CHG和CHH的SMP進(jìn)行全基因組meQTL分析。b.盒須圖顯示順式（cis-）和反式（trans-）meQTL的-log10(P) 分布。顯示中位數(shù)和四分位間距（IQR）。
c.UpsetR圖展示不同DNA甲基化背景下共有順式meQTLs比例。
d.DMR與顯著SNP之間的距離。
e.順式meQTL在全基因組范圍內(nèi)的分布。
f.順式meQTL在不同基因組特征中的富集和缺失情況。
（3）SMPs在表達(dá)調(diào)控中的作用
研究人員進(jìn)一步探討了DNA甲基化與基因表達(dá)之間的關(guān)系。通過(guò)eQTM分析，研究人員共鑒定出5078個(gè)順式eQTMs，涉及3505個(gè)蛋白編碼基因（PCGs）和1573個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）。這些eQTM基因在長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝、毛狀體分支和葡萄糖穩(wěn)態(tài)等過(guò)程中富集，可能與纖維發(fā)育相關(guān)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，CG甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中起著更為重要的作用。在順式eQTMs中，90%的eQTM基因與CG甲基化相關(guān)。這些結(jié)果表明，DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，尤其是CG甲基化。
圖3：受DNA甲基化調(diào)控的基因表達(dá)變異。
a.eQTL分析的工作流程。b.在PCGs和lncRNAs中鑒定出的順式eQTMs數(shù)量。
c.受DNA甲基化調(diào)控的PCGs和lncRNAs比例。
d.重疊和特定的順式eQTM基因的UpsetR圖。右側(cè)：PCGs；左側(cè)：lncRNAs。
e.靠前SMPs與相關(guān)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。左側(cè)：PCGs；右側(cè)：lncRNAs。
f.高置信度eSNP-表達(dá)關(guān)聯(lián)散點(diǎn)圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)檢測(cè)到的eQTL。
g.順式和反式eQTLs數(shù)量的餅圖。
h.eQTM和meQTL分析中鑒定出的eQTM基因表征。這些位點(diǎn)被分為三組。遺傳和順式表觀遺傳調(diào)控（類型I）、遺傳和反式表觀遺傳調(diào)控（類型II）以及僅表觀遺傳調(diào)控（類型III）。
（4）表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（EWAS）揭示了大量與農(nóng)藝性狀相關(guān)的優(yōu)異表觀等位基因
研究人員利用SMPs進(jìn)行了表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（EWAS），鑒定出1715個(gè)與纖維產(chǎn)量和品質(zhì)性狀相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)。其中，1010個(gè)位點(diǎn)與產(chǎn)量相關(guān)性狀相關(guān)，705個(gè)位點(diǎn)與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)。這些表觀遺傳位點(diǎn)中，只有16個(gè)（0.93%）與GWAS位點(diǎn)重疊。例如，研究人員在A11染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與衣分（lint percentage, LP）相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于一個(gè)編碼核孔復(fù)合體相互作用組分（Nup93）的基因啟動(dòng)子區(qū)域。不同表觀等位基因?qū)?yīng)的LP值存在顯著差異。這些結(jié)果表明，DNA甲基化為農(nóng)藝性狀提供了額外的調(diào)控層，并且大多數(shù)表觀遺傳位點(diǎn)與遺傳變異獨(dú)立存在。
圖4：EWAS位點(diǎn)分布及其對(duì)農(nóng)藝性狀的累積效應(yīng)。
a.與農(nóng)藝性狀相關(guān)的EWAS位點(diǎn)分布。纖維產(chǎn)量性狀包括衣分（LP）；纖維品質(zhì)：纖維長(zhǎng)度（FL）、強(qiáng)度（FS）、伸長(zhǎng)率（FE）、細(xì)度（FM）和均勻度（FU）。與每個(gè)性狀相關(guān)的位點(diǎn)在染色體圖上以黑色垂直線表示。b.UpsetR圖展示CG-EWAS、CHG-EWAS和CHH-EWAS之間的重疊。
c.與小于2-kb和5-kb區(qū)域內(nèi)有側(cè)翼基因的EWAS位點(diǎn)比例。
d.EWAS分析LP性狀的曼哈頓圖。紅色箭頭表示在A11染色體上的信號(hào)。
e.放大圖顯示靠前SMP代表A11染色體上LP的EWAS位點(diǎn)，且信號(hào)坐標(biāo)位于同一甲基化不平衡塊中。
f.不同表觀等位基因的LP值，用于e中所示的位點(diǎn)。
g.根據(jù)CG-、CHG-和CHH-EWAS位點(diǎn)以及GWAS位點(diǎn)顯示自然種群中單倍型分布的熱圖。優(yōu)異等位基因用紅色表示。每一列代表一個(gè)材料，每一行指基因組中的一個(gè)位點(diǎn)。
h.對(duì)在EWAS和GWAS中鑒定出的位點(diǎn)表征描述。這些位點(diǎn)被分為四組。僅表觀遺傳調(diào)控（類型I）、僅遺傳調(diào)控（類型II）、遺傳/順式表觀遺傳調(diào)控（類型III）以及遺傳/反式表觀遺傳調(diào)控（類型IV）。
（5）通過(guò)多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析鑒定纖維相關(guān)基因
研究人員通過(guò)整合GWAS、eQTL和EWAS結(jié)果，構(gòu)建了纖維性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究人員發(fā)現(xiàn)，51個(gè)GWAS位點(diǎn)與376個(gè)eQTL在同一個(gè)連鎖不平衡（LD）塊內(nèi)共定位�；贚D塊分析，研究人員構(gòu)建了一個(gè)包含397個(gè)基因的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，研究人員還構(gòu)建了一個(gè)基于EWAS和eQTM的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)比較這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)，研究人員發(fā)現(xiàn)它們之間只有四個(gè)共有基因。這些結(jié)果表明，纖維性狀的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，涉及遺傳和表觀遺傳的多重調(diào)控。
圖5：與纖維發(fā)育相關(guān)的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
a.功能性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）構(gòu)建的分析流程。分別進(jìn)行eQTM和eQTL分析，以獲得EWAS和GWAS位點(diǎn)中的因果位點(diǎn)。將同一連鎖不平衡（LD）塊內(nèi)的位點(diǎn)合并為一個(gè)主要SNP，LD塊內(nèi)的eGenes被聚類成一個(gè)GRN。對(duì)EWAS位點(diǎn)也進(jìn)行相同步驟。b.調(diào)控棉花纖維性狀的基因網(wǎng)絡(luò)。右側(cè)：通過(guò)整合GWAS和eQTL構(gòu)建的遺傳變異依賴網(wǎng)絡(luò)；左側(cè)：通過(guò)整合EWAS和eQTM構(gòu)建的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
c.通過(guò)共定位分析確定的候選基因熱圖。
d.不同表觀等位基因中CIPK10的表達(dá)水平和LP值。
e.基因編輯（CRISPR敲除，CR-KO）對(duì)調(diào)控纖維性狀的eQTM基因GhCIPK10的性能的圖像。
f.兩條CIPK10CR-KO品系的纖維長(zhǎng)度。
（6）基于DNA序列使用DeepFDML預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)
研究人員開發(fā)了一個(gè)名為DeepFDML的深度學(xué)習(xí)模型，用于預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)。該模型基于2336個(gè)與基因表達(dá)變異相關(guān)的CG位點(diǎn)進(jìn)行訓(xùn)練。研究人員使用one-hot encoding將每個(gè)CG位點(diǎn)的側(cè)翼序列轉(zhuǎn)換為模型input。通過(guò)五折交叉驗(yàn)證，該模型的準(zhǔn)確率達(dá)到了0.65。研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)更復(fù)雜的DeepFDML模型，該模型采用了預(yù)訓(xùn)練的Enformer模型作為其主干網(wǎng)絡(luò)。該模型的接收者操作特征曲線（ROC）和精確召回曲線（PRC）分別達(dá)到了0.82和0.78，顯著優(yōu)于卷積模型。這些結(jié)果表明，基于DNA序列的深度學(xué)習(xí)模型可以有效預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)。
圖6：用于功能性CG位點(diǎn)預(yù)測(cè)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
a.所提出的深度學(xué)習(xí)方法的流程示意圖。它主要包括四個(gè)部分：input序列、主干網(wǎng)絡(luò)、特征選擇和output層。每個(gè)input是一個(gè)以CG位點(diǎn)為中心的8192bp的DNA序列，經(jīng)過(guò)one-hot encoding處理。主干網(wǎng)絡(luò)采用預(yù)訓(xùn)練的Enformer模型。在特征選擇階段，利用了中間八個(gè)位置的特征。output層是一個(gè)作為二元分類器的全連接層。b.在整個(gè)數(shù)據(jù)集上測(cè)量的接收者操作特征（ROC）曲線。
c.在整個(gè)數(shù)據(jù)集上測(cè)量的精確率-召回率曲線（PRC）。
討論和啟示
本研究證明了DNA甲基化數(shù)據(jù)在作物育種中的重要應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)整合表觀組（DNA甲基化）、轉(zhuǎn)錄組、基因組的多組學(xué)數(shù)據(jù)，研究人員不僅發(fā)現(xiàn)了大量與纖維性狀相關(guān)的表觀遺傳位點(diǎn)，還通過(guò)基因編輯技術(shù)驗(yàn)證了關(guān)鍵基因的功能。這些發(fā)現(xiàn)為棉花育種提供了新的策略，有助于加速作物改良進(jìn)程。
此外，研究人員開發(fā)的DeepFDML模型為預(yù)測(cè)功能性CG甲基化位點(diǎn)提供了一種新的方法，這將有助于未來(lái)在其他物種中進(jìn)行類似的研究。本研究強(qiáng)調(diào)了DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控和性狀改良中的重要作用，為表觀遺傳學(xué)在作物改良中的應(yīng)用提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：
Zhao, T., Guan, X., Hu, Y. et al. Population-wide DNA methylation polymorphisms at single-nucleotide resolution in 207 cotton accessions reveal epigenomic contributions to complex traits. Cell Res 34, 859–872 (2024). Doi:10.1038/s41422-024-01027-x
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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