基于C-CRISPR優(yōu)化的跨物種囊胚互補實現(xiàn)小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織
場景恐懼 | 吳軍/楊輝/周海波/郭帆團隊在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織
論文上線截圖
這篇發(fā)表于《Cell》的研究報道了一種基于C-CRISPR優(yōu)化的跨物種囊胚互補（IBC）技術，實現(xiàn)了在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織。研究者通過快速篩選候選基因，發(fā)現(xiàn)Hesx1基因缺失的小鼠胚胎為大鼠胚胎干細胞（rESCs）提供了發(fā)育空位，成功重建了結構和功能正常的異種大鼠前腦。該前腦組織在小鼠宿主體內(nèi)以小鼠的發(fā)育節(jié)奏生長，但保持了大鼠特異的轉(zhuǎn)錄組特征，顯示出細胞自主性和非細胞自主性機制共同調(diào)控的復雜發(fā)育過程。功能評估包括神經(jīng)元電生理記錄和行為學測試，均表明重建的前腦具備正常神經(jīng)功能。研究還揭示了發(fā)育中期至晚期存在的異種細胞競爭和排斥障礙，提示未來需克服這些屏障以提高異種嵌合效率。該工作不僅首次實現(xiàn)了腦組織的跨物種囊胚互補，開辟了利用異種胚胎干細胞研究腦發(fā)育、認知功能及進化機制的新途徑，也為解決器官移植供體短缺提供了潛在技術平臺。
1.CCBC技術通過高效敲除Hesx1基因成功構建前腦發(fā)育缺陷模型，并實現(xiàn)90%以上的前腦組織重建效率
作者首先系統(tǒng)性地展示了基于C-CRISPR的囊胚互補技術（CCBC）在器官再生研究中的應用。如圖1A左所示，研究者將C-CRISPR技術與傳統(tǒng)囊胚互補技術相結合，開發(fā)出CCBC這一創(chuàng)新方法，該方法能快速篩選候選基因并一步生成基因敲除動物。在概念驗證階段（圖1A右），研究者針對7個Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因進行篩選�；蚓庉嬓黍炞C顯示（圖1B），所有候選基因均可被高效敲除，其中Dkk1、Hesx1和Six3的敲除導致顯著的前腦發(fā)育缺陷（圖1C,D）。進一步的嵌合體實驗證實（圖1E,F），在Dkk1−/−和Hesx1−/−胚胎中注射mESCs可成功重建完整異源前腦，其中Hesx1−/−嵌合體表現(xiàn)出97.06%的高效前腦重構率（圖1H,I）；而Six3−/−胚胎則無法被供體細胞挽救（圖1E,F）。在新生嵌合體分析中（圖1G），Dkk1−/−+mESCs組獲得55只（90.16%）成功重建前腦的個體，進一步證實了該技術的可靠性。這些結果不僅驗證了CCBC技術的高效性，更揭示了不同基因在前腦發(fā)育中的特異性作用，為復雜器官的再生研究提供了重要技術平臺和理論依據(jù)。
2. Hesx1敲除背景下小鼠前腦的種內(nèi)胚胎干細胞補償
接下來，作者通過將tdTomato+ mESCs注入Hesx1−/−（由CAG啟動子驅(qū)動EGFP表達）囊胚，成功構建了EGFP-tdTomato雙標記嵌合體（圖2A-B）。在Hesx1−/−+mESCs嵌合體中，前腦（大腦皮層和海馬區(qū)）幾乎全部（~100%）由供體來源的tdTomato+細胞構成，顯著高于WT+mESCs嵌合體的~50%（圖2C-2E）；而中腦嵌合率仍維持在約50%（圖2E），表明Hesx1缺失導致的前腦生態(tài)位空缺可被供體細胞完全填補。所有嵌合小鼠均存活至成年，且腦部大小與對照組無差異（圖2F-2H）。以上結果證明Hesx1缺失可特異性實現(xiàn)小鼠前腦的高效供體細胞嵌合，為種內(nèi)前腦互補提供了概念驗證。
圖2.Hesx1−/−小鼠前腦的種內(nèi)囊胚互補
3.小鼠內(nèi)IBC介導的大鼠前腦構建
其次，作者通過CCBC生成rESC衍生前腦組織（圖3A）。圖3B為WT+rESCs和Hesx1/+rESCs嵌合體在P3和20個月時的代表性圖像。在Hesx1−/−嵌合體中，大鼠來源的tdTomato+細胞在皮層和海馬區(qū)占比更高（圖3C-3E）。功能實驗證實，rESCs衍生的神經(jīng)元能形成完整的軸突投射通路：從前外側運動皮層（ALM）投射至丘腦、上丘和延髓等靶區(qū)（圖3F），且投射纖維同時表達EGFP和tdTomato雙標記信號（圖3G）。電生理實驗表明，嵌合體中的大鼠和小鼠皮層神經(jīng)元均能產(chǎn)生正常的動作電位（圖3H-3K），且兩者的輸入阻抗（圖3L）、靜息膜電位（圖3M）及閾值電流（圖3N）均無顯著差異。綜上，Hesx1−/− rESCs能高效生成前腦組織并整合到宿主神經(jīng)環(huán)路中，其衍生的神經(jīng)元具有正常的電生理特性和長距離投射能力。
圖3.通過IBC在小鼠中生成大鼠前腦組織
4. 跨物種嵌合體與同物種嵌合體中，重建的前腦均具備正常的結構和功能
Hesx1−/−+rESCs嵌合體與WT+mESCs及Hesx1−/−+mESCs嵌合體的體重增長曲線相似（圖4A），且三組嵌合體的大腦皮層V區(qū)及海馬區(qū)均表達神經(jīng)標記CTIP2，皮層厚度與細胞密度無顯著差異（圖4B–4E）。行為學測試（Morris水迷宮、曠場實驗及恐懼條件反射）進一步表明，各組嵌合體的認知功能均正常（圖4F–4H）。綜上，種間嵌合體重構的前腦在結構與功能上均發(fā)育正常。
圖4.種內(nèi)或種間嵌合體重構的前腦在結構和功能上均表現(xiàn)正常
5. 發(fā)育中晚期的異種屏障
在Hesx1−/−+rESCs嵌合體發(fā)育過程中，隨著胚胎生長，大鼠細胞在小鼠胎兒中的整體嵌合率從約60%逐漸下降至E17.5時的20%，而前腦區(qū)域的嵌合水平也從早期的90%-100%顯著降低至E15.5時的約60%（圖5A–5C）。這些數(shù)據(jù)表明，大鼠和小鼠之間存在妊娠中晚期的種間屏障，導致嵌合效率下降。以上結果表明異種嵌合體在發(fā)育中晚期面臨顯著的種間限制，需進一步優(yōu)化方法以提高嵌合率。
圖5.Hesx1−/−+rESCs嵌合體中供體大鼠細胞的動態(tài)貢獻
6. 大鼠-小鼠嵌合前腦重構中的細胞自主與非自主作用
Hesx1−/−+rESCs（大鼠-小鼠嵌合體）胚胎的腦發(fā)育速率與野生型小鼠及Hesx1−/−+mESCs（小鼠-小鼠嵌合體）一致（圖6A），表明嵌合體內(nèi)大鼠腦組織的發(fā)育與小鼠宿主同步。單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析（圖6B-6D）發(fā)現(xiàn)，rESC在嵌合前腦中分化為興奮性神經(jīng)元（EXs）、抑制性神經(jīng)元（INs）等多種細胞類型（圖6E），且其轉(zhuǎn)錄組特征與野生型大鼠神經(jīng)元相似，而宿主Hesx1−/−小鼠神經(jīng)元則保持小鼠特征（圖6F、6G）。差異基因分析（圖6H）顯示，部分基因在軸突發(fā)生、前腦發(fā)育等通路中富集（圖6I、6J）。以上結果表明嵌合體內(nèi)大鼠神經(jīng)元的發(fā)育和轉(zhuǎn)錄組特征主要由細胞自主性機制調(diào)控，同時受宿主微環(huán)境部分影響。
圖6.前腦重建型大鼠-小鼠嵌合體中的細胞自主性與非細胞自主性效應
SA218 場景恐懼系統(tǒng)
場景恐懼實驗系統(tǒng)（FCS）用于小型嚙齒類動物（大、小鼠）環(huán)境相關條件性恐懼實驗研究。嚙齒類動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的不動狀態(tài)（immobility），動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢�？挂钟羲幒涂怪袠信d奮藥可以明顯縮短不動狀態(tài)持續(xù)的時間。
實驗過程中，實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓練稱為條件性訓練，訓練結束后實驗動物進行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應，如靜止不動。這種測試可以在訓練結束后立刻或幾天后進行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。
SA201 Morris水迷宮
Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）實驗是一種強迫實驗動物（大鼠、小鼠）游泳，學習尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感（空間定位）的學習記憶能力。被廣泛應用于學習記憶、老年癡呆、海馬/外海馬研究、智力與衰老、新藥開發(fā)/篩選/評價、藥理學、毒理學、預防醫(yī)學、神經(jīng)生物學、動物心理學及行為生物學等多個學科的科學研究和計算機輔助教學等領域。
SA215 曠場視頻分析系統(tǒng)
曠場實驗視頻分析系統(tǒng)（open field test）是觀察研究實驗動物神經(jīng)精神變化、進入開闊環(huán)境后的各種行為，例如動物對新開闊環(huán)境的恐懼而主要在周邊區(qū)域活動，在中央?yún)^(qū)域活動較少，但動物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動的動機，也可觀察由此而產(chǎn)生的焦慮心理。中樞興奮藥物可以明顯增加自主的活動而減少探究行為，一定劑量的抗精神病藥物可以減少探究行為而不影響自主活動。
論文上線截圖
這篇發(fā)表于《Cell》的研究報道了一種基于C-CRISPR優(yōu)化的跨物種囊胚互補（IBC）技術，實現(xiàn)了在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織。研究者通過快速篩選候選基因，發(fā)現(xiàn)Hesx1基因缺失的小鼠胚胎為大鼠胚胎干細胞（rESCs）提供了發(fā)育空位，成功重建了結構和功能正常的異種大鼠前腦。該前腦組織在小鼠宿主體內(nèi)以小鼠的發(fā)育節(jié)奏生長，但保持了大鼠特異的轉(zhuǎn)錄組特征，顯示出細胞自主性和非細胞自主性機制共同調(diào)控的復雜發(fā)育過程。功能評估包括神經(jīng)元電生理記錄和行為學測試，均表明重建的前腦具備正常神經(jīng)功能。研究還揭示了發(fā)育中期至晚期存在的異種細胞競爭和排斥障礙，提示未來需克服這些屏障以提高異種嵌合效率。該工作不僅首次實現(xiàn)了腦組織的跨物種囊胚互補，開辟了利用異種胚胎干細胞研究腦發(fā)育、認知功能及進化機制的新途徑，也為解決器官移植供體短缺提供了潛在技術平臺。
1.CCBC技術通過高效敲除Hesx1基因成功構建前腦發(fā)育缺陷模型，并實現(xiàn)90%以上的前腦組織重建效率
作者首先系統(tǒng)性地展示了基于C-CRISPR的囊胚互補技術（CCBC）在器官再生研究中的應用。如圖1A左所示，研究者將C-CRISPR技術與傳統(tǒng)囊胚互補技術相結合，開發(fā)出CCBC這一創(chuàng)新方法，該方法能快速篩選候選基因并一步生成基因敲除動物。在概念驗證階段（圖1A右），研究者針對7個Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因進行篩選�；蚓庉嬓黍炞C顯示（圖1B），所有候選基因均可被高效敲除，其中Dkk1、Hesx1和Six3的敲除導致顯著的前腦發(fā)育缺陷（圖1C,D）。進一步的嵌合體實驗證實（圖1E,F），在Dkk1−/−和Hesx1−/−胚胎中注射mESCs可成功重建完整異源前腦，其中Hesx1−/−嵌合體表現(xiàn)出97.06%的高效前腦重構率（圖1H,I）；而Six3−/−胚胎則無法被供體細胞挽救（圖1E,F）。在新生嵌合體分析中（圖1G），Dkk1−/−+mESCs組獲得55只（90.16%）成功重建前腦的個體，進一步證實了該技術的可靠性。這些結果不僅驗證了CCBC技術的高效性，更揭示了不同基因在前腦發(fā)育中的特異性作用，為復雜器官的再生研究提供了重要技術平臺和理論依據(jù)。
圖1.CCBC技術為神經(jīng)囊胚互補提供了快速遺傳篩選方案
2. Hesx1敲除背景下小鼠前腦的種內(nèi)胚胎干細胞補償
接下來，作者通過將tdTomato+ mESCs注入Hesx1−/−（由CAG啟動子驅(qū)動EGFP表達）囊胚，成功構建了EGFP-tdTomato雙標記嵌合體（圖2A-B）。在Hesx1−/−+mESCs嵌合體中，前腦（大腦皮層和海馬區(qū)）幾乎全部（~100%）由供體來源的tdTomato+細胞構成，顯著高于WT+mESCs嵌合體的~50%（圖2C-2E）；而中腦嵌合率仍維持在約50%（圖2E），表明Hesx1缺失導致的前腦生態(tài)位空缺可被供體細胞完全填補。所有嵌合小鼠均存活至成年，且腦部大小與對照組無差異（圖2F-2H）。以上結果證明Hesx1缺失可特異性實現(xiàn)小鼠前腦的高效供體細胞嵌合，為種內(nèi)前腦互補提供了概念驗證。
圖2.Hesx1−/−小鼠前腦的種內(nèi)囊胚互補
3.小鼠內(nèi)IBC介導的大鼠前腦構建
其次，作者通過CCBC生成rESC衍生前腦組織（圖3A）。圖3B為WT+rESCs和Hesx1/+rESCs嵌合體在P3和20個月時的代表性圖像。在Hesx1−/−嵌合體中，大鼠來源的tdTomato+細胞在皮層和海馬區(qū)占比更高（圖3C-3E）。功能實驗證實，rESCs衍生的神經(jīng)元能形成完整的軸突投射通路：從前外側運動皮層（ALM）投射至丘腦、上丘和延髓等靶區(qū)（圖3F），且投射纖維同時表達EGFP和tdTomato雙標記信號（圖3G）。電生理實驗表明，嵌合體中的大鼠和小鼠皮層神經(jīng)元均能產(chǎn)生正常的動作電位（圖3H-3K），且兩者的輸入阻抗（圖3L）、靜息膜電位（圖3M）及閾值電流（圖3N）均無顯著差異。綜上，Hesx1−/− rESCs能高效生成前腦組織并整合到宿主神經(jīng)環(huán)路中，其衍生的神經(jīng)元具有正常的電生理特性和長距離投射能力。
圖3.通過IBC在小鼠中生成大鼠前腦組織
4. 跨物種嵌合體與同物種嵌合體中，重建的前腦均具備正常的結構和功能
Hesx1−/−+rESCs嵌合體與WT+mESCs及Hesx1−/−+mESCs嵌合體的體重增長曲線相似（圖4A），且三組嵌合體的大腦皮層V區(qū)及海馬區(qū)均表達神經(jīng)標記CTIP2，皮層厚度與細胞密度無顯著差異（圖4B–4E）。行為學測試（Morris水迷宮、曠場實驗及恐懼條件反射）進一步表明，各組嵌合體的認知功能均正常（圖4F–4H）。綜上，種間嵌合體重構的前腦在結構與功能上均發(fā)育正常。
圖4.種內(nèi)或種間嵌合體重構的前腦在結構和功能上均表現(xiàn)正常
5. 發(fā)育中晚期的異種屏障
在Hesx1−/−+rESCs嵌合體發(fā)育過程中，隨著胚胎生長，大鼠細胞在小鼠胎兒中的整體嵌合率從約60%逐漸下降至E17.5時的20%，而前腦區(qū)域的嵌合水平也從早期的90%-100%顯著降低至E15.5時的約60%（圖5A–5C）。這些數(shù)據(jù)表明，大鼠和小鼠之間存在妊娠中晚期的種間屏障，導致嵌合效率下降。以上結果表明異種嵌合體在發(fā)育中晚期面臨顯著的種間限制，需進一步優(yōu)化方法以提高嵌合率。
圖5.Hesx1−/−+rESCs嵌合體中供體大鼠細胞的動態(tài)貢獻
6. 大鼠-小鼠嵌合前腦重構中的細胞自主與非自主作用
Hesx1−/−+rESCs（大鼠-小鼠嵌合體）胚胎的腦發(fā)育速率與野生型小鼠及Hesx1−/−+mESCs（小鼠-小鼠嵌合體）一致（圖6A），表明嵌合體內(nèi)大鼠腦組織的發(fā)育與小鼠宿主同步。單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析（圖6B-6D）發(fā)現(xiàn)，rESC在嵌合前腦中分化為興奮性神經(jīng)元（EXs）、抑制性神經(jīng)元（INs）等多種細胞類型（圖6E），且其轉(zhuǎn)錄組特征與野生型大鼠神經(jīng)元相似，而宿主Hesx1−/−小鼠神經(jīng)元則保持小鼠特征（圖6F、6G）。差異基因分析（圖6H）顯示，部分基因在軸突發(fā)生、前腦發(fā)育等通路中富集（圖6I、6J）。以上結果表明嵌合體內(nèi)大鼠神經(jīng)元的發(fā)育和轉(zhuǎn)錄組特征主要由細胞自主性機制調(diào)控，同時受宿主微環(huán)境部分影響。
圖6.前腦重建型大鼠-小鼠嵌合體中的細胞自主性與非細胞自主性效應
SA218 場景恐懼系統(tǒng)
實驗過程中，實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓練稱為條件性訓練，訓練結束后實驗動物進行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應，如靜止不動。這種測試可以在訓練結束后立刻或幾天后進行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。
SA201 Morris水迷宮
Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）實驗是一種強迫實驗動物（大鼠、小鼠）游泳，學習尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感（空間定位）的學習記憶能力。被廣泛應用于學習記憶、老年癡呆、海馬/外海馬研究、智力與衰老、新藥開發(fā)/篩選/評價、藥理學、毒理學、預防醫(yī)學、神經(jīng)生物學、動物心理學及行為生物學等多個學科的科學研究和計算機輔助教學等領域。
SA215 曠場視頻分析系統(tǒng)
標簽：
場景恐懼系統(tǒng)
曠場實驗
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com