DNA甲基化助力揭示花青素生物合成調(diào)控柑橘果實(shí)品質(zhì)的表觀新機(jī)制
近日，浙江省農(nóng)科院亞熱帶作物研究所張培安助理研究員為第一作者、劉冬峰副研究員為通訊作者，在《BMC Plant Biology》雜志發(fā)表題為“Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange”的研究論文，研究聚焦中國(guó)常見的血橙（蕓香科柑橘屬）品種Tarocco及其在溫州發(fā)現(xiàn)的芽變品種Ouya（MT），討論了MT果實(shí)中花青素生物合成受抑制的品質(zhì)特性及分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，MT果實(shí)具有更優(yōu)的糖酸比、更大的果實(shí)重量和尺寸，且成熟期比WT提前約1個(gè)月，具備較高的推廣價(jià)值。在分子水平上，研究人員鑒定出多個(gè)與花青素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄因子和甲基化相關(guān)基因，并通過WGBS+RNA-seq聯(lián)合分析，驗(yàn)證了DNA甲基化在花青素積累中的調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅為血橙果實(shí)品質(zhì)改良提供了新的基因資源和靶點(diǎn)，也為其他柑橘品種的遺傳改良提供參考。
研究人員收集了Tarocco（野生型，WT）和芽變品種Ouya（MT）的果實(shí)，共九個(gè)發(fā)育階段，檢測(cè)其花青素、可溶性糖和有機(jī)酸含量，并在三個(gè)發(fā)育階段對(duì)轉(zhuǎn)錄組和代謝物進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明，MT是一個(gè)新的花青素含量低、糖酸比優(yōu)于WT的血橙品種。與WT果實(shí)相比，MT果實(shí)中花青素的含量顯著降低，尤其是矢車菊素類花青素（cyanidin-like anthocyanins），而黃酮類化合物含量沒有顯著變化。在WT和MT的三個(gè)果實(shí)發(fā)育階段，共鑒定出64個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），包括5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、5個(gè)甲基化相關(guān)基因和1個(gè)黃酮類生物合成基因。進(jìn)一步利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）構(gòu)建這些TFs的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，經(jīng)5-氮雜胞苷（5-aza）處理的MT果實(shí)果肉中，積累的花青素以及一些花青素合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子和基因區(qū)域存在低甲基化。這些結(jié)果為研究DNA甲基化對(duì)MT果實(shí)中花青素積累的作用提供了新的見解，并為推廣MT作為一個(gè)新品種提供支持。
易小結(jié)
該研究通過WGBS+RNA-seq技術(shù)聯(lián)合分析，深入探究了MT果實(shí)中花青素合成受抑制的分子機(jī)制。不僅為理解DNA甲基化對(duì)MT果實(shí)花青素積累的影響提供了新見解，而且為MT作為一種新的血橙品種的推廣提供了支持。
WGBS分析揭示了DNA甲基化在花青素合成相關(guān)基因調(diào)控中的重要作用，而RNA-seq則鑒定出多個(gè)與花青素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄因子和甲基化相關(guān)基因。這些發(fā)現(xiàn)不僅為血橙果實(shí)品質(zhì)改良提供了新的基因資源和靶點(diǎn)，也為其他柑橘品種的遺傳改良提供了參考。此外，本研究還強(qiáng)調(diào)了WGBS+RNA-seq技術(shù)在揭示植物次生代謝產(chǎn)物生物合成和調(diào)控機(jī)制中的重要作用，為未來類似作物研究提供了有力的技術(shù)支持和應(yīng)用范例，有助于挖掘更多與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的基因和調(diào)控元件，推動(dòng)農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
研究方法
植物材料：收集WT和MT果實(shí)樣本，每15天采集一次，共采集九個(gè)樣本，每個(gè)樣本包含10個(gè)果實(shí)。
外觀性狀分析：果實(shí)重量和尺寸；果皮和果肉顏色參數(shù)。
理化性質(zhì)檢測(cè)：可溶性固形物、可溶性糖、有機(jī)酸、維生素C和總類胡蘿卜素含量；總花青素及其組分含量分析。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）：從開花后（days after flowering，DAF）235、265和280天收集的WT和MT果肉中提取總RNA，分別命名為WT1 / MT1、WT2 / MT2和WT3 / MT3并進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)文庫包含40.8-85.2M的clean reads，與參考基因組比對(duì)，篩選出DEGs，并進(jìn)行KEGG和GO富集分析。
WGCNA分析：構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、模塊和基因選擇以及模塊基因的功能分析。通過模塊特征基因與樣本性狀的相關(guān)性分析，篩選出與花青素含量和果實(shí)品質(zhì)性狀相關(guān)的模塊。
全基因組亞硫酸鹽測(cè)序分析（WGBS）+RNA-seq：經(jīng)5-aza處理235DAF收集MT果實(shí)，處理7天后，將果實(shí)切成兩半，取果肉樣本進(jìn)行RNA-seq和WGBS分析，分析其DNA甲基化水平和基因表達(dá)變化之間的關(guān)系。
結(jié)果圖形
（1）理化性質(zhì)
在160-235 DAF期間，WT果實(shí)的果皮顏色比MT果實(shí)更橙紅，而220 DAF之前，兩種品種的果肉顏色相似，均未檢測(cè)到花青素積累。220 DAF后，MT果肉顏色顯著淺于WT，WT果皮邊緣開始變紅，隨后紅色逐漸向中心擴(kuò)散，到280 DAF時(shí)，整個(gè)果肉呈絲狀紅色，而MT僅邊緣有紅色。果皮和果肉的顏色參數(shù)在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出顯著差異，反映了兩種品種果實(shí)顏色的變化。
在果實(shí)重量、尺寸、可溶性固形物（TSS）、可溶性糖和有機(jī)酸含量方面，MT果實(shí)的直徑和重量均顯著大于WT，280 DAF時(shí)MT果實(shí)重量為254.08g，WT為242.36g。MT的TSS含量在190DAF時(shí)超過15°Brix，而WT僅為12.91°Brix，且隨著果實(shí)成熟，MT的TSS、可溶性糖含量均顯著高于WT，而有機(jī)酸含量則相反，尤其是檸檬酸，導(dǎo)致MT的糖酸比在190 DAF后顯著高于WT。此外，280 DAF時(shí)，兩種品種果實(shí)果肉中的維生素C含量差異不顯著，但WT的類胡蘿卜素含量顯著高于MT。
圖1：Tarocco（WT）及其芽變品種（MT）在不同發(fā)育階段的外觀（A）及果皮和果肉中總花青素含量（B）。
（2）總花青素及其組分含量變化
兩種品種果實(shí)果皮和果肉中總花青素含量的變化趨勢(shì)與果實(shí)外觀變化相似，220 DAF之前未檢測(cè)到花青素。隨著果實(shí)成熟，果肉中總花青素含量相對(duì)較低，且在220和235 DAF時(shí)兩類品種間無顯著差異。從250 DAF到280 DAF，WT果實(shí)的果皮和果肉中總花青素含量均顯著高于MT。在235、265和280 DAF收集的果肉樣本中，共檢測(cè)到38種花青素和6種黃烷酮，其中矢車菊素類花青素含量相對(duì)較高，且隨著果實(shí)成熟，花青素含量在WT中顯著高于MT。此外還檢測(cè)到黃酮類化合物含量在WT中也顯著高于MT。在不同組間比較花青素和黃酮類化合物的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)235 DAF時(shí)WT和MT果實(shí)間有4種差異代謝物，265 DAF時(shí)有7種，280 DAF時(shí)有19種。在相同品種中，與235DAF相比，265 DAF和280 DAF大多數(shù)（分別為11種和9種）差異代謝物在WT和MT中共同差異合成。
圖2：不同發(fā)育階段 Tarocco（WT）及其芽變品種（MT）果肉中花青素組分熱圖（A）和維恩圖（B-D）。
表1：不同采樣時(shí)期WT和MT果肉中主要花青素和黃酮類化合物含量（µg·g⁻¹）。
（3）不同發(fā)育階段WT和MT果實(shí)的RNA-seq分析
為分析WT和MT果實(shí)花青素合成差異的分子機(jī)制，研究人員對(duì)檢測(cè)到花青素組分樣本進(jìn)行RNA-seq分析。樣本間相關(guān)性分析顯示三個(gè)生物學(xué)重復(fù)間具有良好的可重復(fù)性，WT1和WT2間變異性最小，而WT1、MT3、MT1和WT3間差異相對(duì)較大。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的WT和MT組間進(jìn)行比較，235 DAF時(shí)鑒定出321個(gè)DEGs，265 DAF時(shí)有734個(gè)，280 DAF時(shí)有816個(gè)，表明隨著果實(shí)成熟，兩種品種間DEGs數(shù)量逐漸增加。在這些DEGs中，有64個(gè)基因在三個(gè)比較組中存在交集，KEGG分析顯示這些交集基因富集在黃酮類生物合成、苯丙素生物合成以及黃酮和黃酮醇生物合成通路中，GO分析則顯示在五個(gè)與甲基化相關(guān)的DEGs中富集，且這些DEGs在WT中的表達(dá)量均高于MT。
圖3：鑒定并分析Tarocco（WT）和其芽變品種（MT）果肉樣本之間DEGs的功能特征。對(duì)以下各組DEGs進(jìn)行KEGG富集分析：（A）WT 1 與 MT 1，（B）WT 2 與 MT 2，（C）WT 3 與 MT 3；（D）維恩圖展示三個(gè)比較組果肉樣本之間共有和特異性基因；（E）對(duì)三個(gè)比較組中共有的64個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG分析。
（4）與花青素和果實(shí)品質(zhì)性狀相關(guān)的WGCNA模塊鑒定
通過WGCNA，研究人員將基于13個(gè)性狀（包括不同花青素組分、可溶性糖和有機(jī)酸）的9,571個(gè)基因進(jìn)行分組，構(gòu)建了7個(gè)模塊，分別用不同顏色表示。其中，藍(lán)色模塊與花青素合成相關(guān)性最高，與總花青素和四種特定花青素組分高度相關(guān)，且富集在黃酮類生物合成、苯丙素生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花青素生物合成以及苯丙氨酸代謝等代謝通路中；黃色模塊與總花青素和特定花青素組分呈負(fù)相關(guān)，但也富集在花青素合成相關(guān)途徑以及光合作用相關(guān)通路中。所有在WT和MT間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）被分類到不同模塊中，藍(lán)色模塊在三個(gè)階段中差異表達(dá)的TFs數(shù)量最多，且在三個(gè)階段中鑒定出的五個(gè)TFs均位于藍(lán)色模塊中，表明藍(lán)色模塊中的某些DEGs可能是導(dǎo)致WT和MT果實(shí)花青素差異積累的關(guān)鍵因子。研究人員將這五個(gè)TFs作為中心基因，分析了其與藍(lán)色模塊中黃酮類合成相關(guān)基因的調(diào)控關(guān)聯(lián)，分析結(jié)果表明CsATHB40、CsUNE10和CsRuby可以作為調(diào)控蛋白進(jìn)行自我調(diào)控轉(zhuǎn)錄，并且CsUNE10和CsRuby可以相互調(diào)控，還可以參與調(diào)控藍(lán)色模塊中的黃酮類合成相關(guān)基因，如CsPAL1、CsAOC、Cs4CL1、Cs4CL2、CsCHS、CsCHI和CsCOMT。
圖4：基于13個(gè)性狀（不同花青素組分、可溶性糖和有機(jī)酸）表現(xiàn)，對(duì)9571個(gè)基因進(jìn)行WGCNA分組。
（A）左側(cè)顯示7個(gè)模塊及其包含的基因數(shù)量。右側(cè)顏色表示特定模塊與處理之間的相關(guān)系數(shù)。
（B-C）KEGG分析顯示，與總花青素性狀相關(guān)性最高的正模塊（藍(lán)，B）和負(fù)模塊（黃，C）中的基因。
（D）轉(zhuǎn)錄組共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析展示W(wǎng)GCNA篩選出的模塊中涉及的轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因。
（5）5-aza處理后的基因表達(dá)和DNA甲基化變化
5-aza處理后，MT果實(shí)果肉中檢測(cè)到花青素的顯著積累。通過比較5-aza處理和對(duì)照（CK）樣本的RNA-seq，共鑒定出1,657個(gè)DEGs，其中661個(gè)上調(diào)，996個(gè)下調(diào)。KEGG富集分析顯示，這些DEGs在與花青素合成相關(guān)的苯丙素生物合成和黃酮類生物合成通路中富集。此外，GO富集分析顯示，幾丁質(zhì)和外部包被結(jié)構(gòu)合成類別分別在上調(diào)和下調(diào)基因中富集。在5-aza處理后，與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因（CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H、CsF3'5'H、CsF3'H、CsDFR和CsANS）的表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)錄因子（CsWD40和CsAN1）的表達(dá)水平均顯著提高，但CsRuby表達(dá)未檢測(cè)到顯著變化。研究人員對(duì)5-aza處理組和CK組進(jìn)行了WGBS分析，每個(gè)樣本獲得＞50.93M clean reads（6.63Gb）。比較CK和5-aza處理樣本之間的DNA甲基化變化模式，發(fā)現(xiàn)CK組中CG和CHG甲基化的比例分別為12.94%和15.52%，而CHH甲基化比例相對(duì)較低。此外，在所有CG、CHG和CHH甲基化中，與CK樣本相比，在5-aza處理樣本中，基因的5'和3'區(qū)域（±2K序列）的DNA甲基化水平降低，尤其是在基因啟動(dòng)子和基因體區(qū)域。分析CK和5 - aza組之間的差異甲基化區(qū)域（DMRs）顯示，在CG、CHG和CHH的所有背景下，高甲基化DMRs數(shù)量均高于低甲基化DMRs，且在啟動(dòng)子和外顯子中最為顯著。KEGG分析顯示，CG的DMRs在黃酮類生物合成通路中富集。這些結(jié)果表明，5-aza處理通過降低花青素合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子和基因體區(qū)域的DNA甲基化水平，促進(jìn)了MT果實(shí)果肉中花青素積累。
圖5：基于WGBS分析的芽變品種（MT）在5-aza處理后花青素含量、基因表達(dá)和甲基化水平的變化。（A-B） 5-aza處理后果肉表型和花青素含量的變化。
（C） 利用RNA-seq分析5-aza和CK果肉中的DEGs。
（D） 這些DEGs的KEGG富集分析。
（E） 5-aza和CK處理后果肉中花青素相關(guān)基因的表達(dá)水平。
（F） 合并的CG、CHG和CHH（包括基因體及±2kb區(qū)域）的DNA甲基化圖譜。
（G） 合并的CG、CHG和CHH（3'UTR、5'UTR、外顯子和啟動(dòng)子）的DMR數(shù)。
（H） 花青素相關(guān)基因（CsCHI、CsUDPG、CsC4H、Cs4CL和CsPAL）啟動(dòng)子和基因體區(qū)域的甲基化水平可視化。Hyper，高甲基化；Hypo，低甲基化。
參考文獻(xiàn)：
Zhang, P., Zhao, Q., Song, Y. et al. Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange. BMC Plant Biol 25, 230 (2025). Doi:0.1186/s12870-025-06212-7.
研究人員收集了Tarocco（野生型，WT）和芽變品種Ouya（MT）的果實(shí)，共九個(gè)發(fā)育階段，檢測(cè)其花青素、可溶性糖和有機(jī)酸含量，并在三個(gè)發(fā)育階段對(duì)轉(zhuǎn)錄組和代謝物進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明，MT是一個(gè)新的花青素含量低、糖酸比優(yōu)于WT的血橙品種。與WT果實(shí)相比，MT果實(shí)中花青素的含量顯著降低，尤其是矢車菊素類花青素（cyanidin-like anthocyanins），而黃酮類化合物含量沒有顯著變化。在WT和MT的三個(gè)果實(shí)發(fā)育階段，共鑒定出64個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），包括5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、5個(gè)甲基化相關(guān)基因和1個(gè)黃酮類生物合成基因。進(jìn)一步利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）構(gòu)建這些TFs的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，經(jīng)5-氮雜胞苷（5-aza）處理的MT果實(shí)果肉中，積累的花青素以及一些花青素合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子和基因區(qū)域存在低甲基化。這些結(jié)果為研究DNA甲基化對(duì)MT果實(shí)中花青素積累的作用提供了新的見解，并為推廣MT作為一個(gè)新品種提供支持。
圖形摘要：血橙果實(shí)色澤變化機(jī)制比較
易小結(jié)
該研究通過WGBS+RNA-seq技術(shù)聯(lián)合分析，深入探究了MT果實(shí)中花青素合成受抑制的分子機(jī)制。不僅為理解DNA甲基化對(duì)MT果實(shí)花青素積累的影響提供了新見解，而且為MT作為一種新的血橙品種的推廣提供了支持。
WGBS分析揭示了DNA甲基化在花青素合成相關(guān)基因調(diào)控中的重要作用，而RNA-seq則鑒定出多個(gè)與花青素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄因子和甲基化相關(guān)基因。這些發(fā)現(xiàn)不僅為血橙果實(shí)品質(zhì)改良提供了新的基因資源和靶點(diǎn)，也為其他柑橘品種的遺傳改良提供了參考。此外，本研究還強(qiáng)調(diào)了WGBS+RNA-seq技術(shù)在揭示植物次生代謝產(chǎn)物生物合成和調(diào)控機(jī)制中的重要作用，為未來類似作物研究提供了有力的技術(shù)支持和應(yīng)用范例，有助于挖掘更多與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的基因和調(diào)控元件，推動(dòng)農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
研究方法
植物材料：收集WT和MT果實(shí)樣本，每15天采集一次，共采集九個(gè)樣本，每個(gè)樣本包含10個(gè)果實(shí)。
外觀性狀分析：果實(shí)重量和尺寸；果皮和果肉顏色參數(shù)。
理化性質(zhì)檢測(cè)：可溶性固形物、可溶性糖、有機(jī)酸、維生素C和總類胡蘿卜素含量；總花青素及其組分含量分析。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）：從開花后（days after flowering，DAF）235、265和280天收集的WT和MT果肉中提取總RNA，分別命名為WT1 / MT1、WT2 / MT2和WT3 / MT3并進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)文庫包含40.8-85.2M的clean reads，與參考基因組比對(duì)，篩選出DEGs，并進(jìn)行KEGG和GO富集分析。
WGCNA分析：構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、模塊和基因選擇以及模塊基因的功能分析。通過模塊特征基因與樣本性狀的相關(guān)性分析，篩選出與花青素含量和果實(shí)品質(zhì)性狀相關(guān)的模塊。
全基因組亞硫酸鹽測(cè)序分析（WGBS）+RNA-seq：經(jīng)5-aza處理235DAF收集MT果實(shí)，處理7天后，將果實(shí)切成兩半，取果肉樣本進(jìn)行RNA-seq和WGBS分析，分析其DNA甲基化水平和基因表達(dá)變化之間的關(guān)系。
結(jié)果圖形
（1）理化性質(zhì)
在160-235 DAF期間，WT果實(shí)的果皮顏色比MT果實(shí)更橙紅，而220 DAF之前，兩種品種的果肉顏色相似，均未檢測(cè)到花青素積累。220 DAF后，MT果肉顏色顯著淺于WT，WT果皮邊緣開始變紅，隨后紅色逐漸向中心擴(kuò)散，到280 DAF時(shí)，整個(gè)果肉呈絲狀紅色，而MT僅邊緣有紅色。果皮和果肉的顏色參數(shù)在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出顯著差異，反映了兩種品種果實(shí)顏色的變化。
在果實(shí)重量、尺寸、可溶性固形物（TSS）、可溶性糖和有機(jī)酸含量方面，MT果實(shí)的直徑和重量均顯著大于WT，280 DAF時(shí)MT果實(shí)重量為254.08g，WT為242.36g。MT的TSS含量在190DAF時(shí)超過15°Brix，而WT僅為12.91°Brix，且隨著果實(shí)成熟，MT的TSS、可溶性糖含量均顯著高于WT，而有機(jī)酸含量則相反，尤其是檸檬酸，導(dǎo)致MT的糖酸比在190 DAF后顯著高于WT。此外，280 DAF時(shí)，兩種品種果實(shí)果肉中的維生素C含量差異不顯著，但WT的類胡蘿卜素含量顯著高于MT。
圖1：Tarocco（WT）及其芽變品種（MT）在不同發(fā)育階段的外觀（A）及果皮和果肉中總花青素含量（B）。
（2）總花青素及其組分含量變化
兩種品種果實(shí)果皮和果肉中總花青素含量的變化趨勢(shì)與果實(shí)外觀變化相似，220 DAF之前未檢測(cè)到花青素。隨著果實(shí)成熟，果肉中總花青素含量相對(duì)較低，且在220和235 DAF時(shí)兩類品種間無顯著差異。從250 DAF到280 DAF，WT果實(shí)的果皮和果肉中總花青素含量均顯著高于MT。在235、265和280 DAF收集的果肉樣本中，共檢測(cè)到38種花青素和6種黃烷酮，其中矢車菊素類花青素含量相對(duì)較高，且隨著果實(shí)成熟，花青素含量在WT中顯著高于MT。此外還檢測(cè)到黃酮類化合物含量在WT中也顯著高于MT。在不同組間比較花青素和黃酮類化合物的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)235 DAF時(shí)WT和MT果實(shí)間有4種差異代謝物，265 DAF時(shí)有7種，280 DAF時(shí)有19種。在相同品種中，與235DAF相比，265 DAF和280 DAF大多數(shù)（分別為11種和9種）差異代謝物在WT和MT中共同差異合成。
圖2：不同發(fā)育階段 Tarocco（WT）及其芽變品種（MT）果肉中花青素組分熱圖（A）和維恩圖（B-D）。
表1：不同采樣時(shí)期WT和MT果肉中主要花青素和黃酮類化合物含量（µg·g⁻¹）。
（3）不同發(fā)育階段WT和MT果實(shí)的RNA-seq分析
為分析WT和MT果實(shí)花青素合成差異的分子機(jī)制，研究人員對(duì)檢測(cè)到花青素組分樣本進(jìn)行RNA-seq分析。樣本間相關(guān)性分析顯示三個(gè)生物學(xué)重復(fù)間具有良好的可重復(fù)性，WT1和WT2間變異性最小，而WT1、MT3、MT1和WT3間差異相對(duì)較大。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的WT和MT組間進(jìn)行比較，235 DAF時(shí)鑒定出321個(gè)DEGs，265 DAF時(shí)有734個(gè)，280 DAF時(shí)有816個(gè)，表明隨著果實(shí)成熟，兩種品種間DEGs數(shù)量逐漸增加。在這些DEGs中，有64個(gè)基因在三個(gè)比較組中存在交集，KEGG分析顯示這些交集基因富集在黃酮類生物合成、苯丙素生物合成以及黃酮和黃酮醇生物合成通路中，GO分析則顯示在五個(gè)與甲基化相關(guān)的DEGs中富集，且這些DEGs在WT中的表達(dá)量均高于MT。
圖3：鑒定并分析Tarocco（WT）和其芽變品種（MT）果肉樣本之間DEGs的功能特征。對(duì)以下各組DEGs進(jìn)行KEGG富集分析：（A）WT 1 與 MT 1，（B）WT 2 與 MT 2，（C）WT 3 與 MT 3；（D）維恩圖展示三個(gè)比較組果肉樣本之間共有和特異性基因；（E）對(duì)三個(gè)比較組中共有的64個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG分析。
（4）與花青素和果實(shí)品質(zhì)性狀相關(guān)的WGCNA模塊鑒定
通過WGCNA，研究人員將基于13個(gè)性狀（包括不同花青素組分、可溶性糖和有機(jī)酸）的9,571個(gè)基因進(jìn)行分組，構(gòu)建了7個(gè)模塊，分別用不同顏色表示。其中，藍(lán)色模塊與花青素合成相關(guān)性最高，與總花青素和四種特定花青素組分高度相關(guān)，且富集在黃酮類生物合成、苯丙素生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花青素生物合成以及苯丙氨酸代謝等代謝通路中；黃色模塊與總花青素和特定花青素組分呈負(fù)相關(guān)，但也富集在花青素合成相關(guān)途徑以及光合作用相關(guān)通路中。所有在WT和MT間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）被分類到不同模塊中，藍(lán)色模塊在三個(gè)階段中差異表達(dá)的TFs數(shù)量最多，且在三個(gè)階段中鑒定出的五個(gè)TFs均位于藍(lán)色模塊中，表明藍(lán)色模塊中的某些DEGs可能是導(dǎo)致WT和MT果實(shí)花青素差異積累的關(guān)鍵因子。研究人員將這五個(gè)TFs作為中心基因，分析了其與藍(lán)色模塊中黃酮類合成相關(guān)基因的調(diào)控關(guān)聯(lián)，分析結(jié)果表明CsATHB40、CsUNE10和CsRuby可以作為調(diào)控蛋白進(jìn)行自我調(diào)控轉(zhuǎn)錄，并且CsUNE10和CsRuby可以相互調(diào)控，還可以參與調(diào)控藍(lán)色模塊中的黃酮類合成相關(guān)基因，如CsPAL1、CsAOC、Cs4CL1、Cs4CL2、CsCHS、CsCHI和CsCOMT。
（A）左側(cè)顯示7個(gè)模塊及其包含的基因數(shù)量。右側(cè)顏色表示特定模塊與處理之間的相關(guān)系數(shù)。
（B-C）KEGG分析顯示，與總花青素性狀相關(guān)性最高的正模塊（藍(lán)，B）和負(fù)模塊（黃，C）中的基因。
（D）轉(zhuǎn)錄組共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析展示W(wǎng)GCNA篩選出的模塊中涉及的轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因。
（5）5-aza處理后的基因表達(dá)和DNA甲基化變化
5-aza處理后，MT果實(shí)果肉中檢測(cè)到花青素的顯著積累。通過比較5-aza處理和對(duì)照（CK）樣本的RNA-seq，共鑒定出1,657個(gè)DEGs，其中661個(gè)上調(diào)，996個(gè)下調(diào)。KEGG富集分析顯示，這些DEGs在與花青素合成相關(guān)的苯丙素生物合成和黃酮類生物合成通路中富集。此外，GO富集分析顯示，幾丁質(zhì)和外部包被結(jié)構(gòu)合成類別分別在上調(diào)和下調(diào)基因中富集。在5-aza處理后，與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因（CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H、CsF3'5'H、CsF3'H、CsDFR和CsANS）的表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)錄因子（CsWD40和CsAN1）的表達(dá)水平均顯著提高，但CsRuby表達(dá)未檢測(cè)到顯著變化。研究人員對(duì)5-aza處理組和CK組進(jìn)行了WGBS分析，每個(gè)樣本獲得＞50.93M clean reads（6.63Gb）。比較CK和5-aza處理樣本之間的DNA甲基化變化模式，發(fā)現(xiàn)CK組中CG和CHG甲基化的比例分別為12.94%和15.52%，而CHH甲基化比例相對(duì)較低。此外，在所有CG、CHG和CHH甲基化中，與CK樣本相比，在5-aza處理樣本中，基因的5'和3'區(qū)域（±2K序列）的DNA甲基化水平降低，尤其是在基因啟動(dòng)子和基因體區(qū)域。分析CK和5 - aza組之間的差異甲基化區(qū)域（DMRs）顯示，在CG、CHG和CHH的所有背景下，高甲基化DMRs數(shù)量均高于低甲基化DMRs，且在啟動(dòng)子和外顯子中最為顯著。KEGG分析顯示，CG的DMRs在黃酮類生物合成通路中富集。這些結(jié)果表明，5-aza處理通過降低花青素合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子和基因體區(qū)域的DNA甲基化水平，促進(jìn)了MT果實(shí)果肉中花青素積累。
圖5：基于WGBS分析的芽變品種（MT）在5-aza處理后花青素含量、基因表達(dá)和甲基化水平的變化。（A-B） 5-aza處理后果肉表型和花青素含量的變化。
（D） 這些DEGs的KEGG富集分析。
（E） 5-aza和CK處理后果肉中花青素相關(guān)基因的表達(dá)水平。
（F） 合并的CG、CHG和CHH（包括基因體及±2kb區(qū)域）的DNA甲基化圖譜。
（G） 合并的CG、CHG和CHH（3'UTR、5'UTR、外顯子和啟動(dòng)子）的DMR數(shù)。
（H） 花青素相關(guān)基因（CsCHI、CsUDPG、CsC4H、Cs4CL和CsPAL）啟動(dòng)子和基因體區(qū)域的甲基化水平可視化。Hyper，高甲基化；Hypo，低甲基化。
參考文獻(xiàn)：
Zhang, P., Zhao, Q., Song, Y. et al. Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange. BMC Plant Biol 25, 230 (2025). Doi:0.1186/s12870-025-06212-7.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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