膜過濾法在生物負(fù)荷測試中的應(yīng)用

生物負(fù)荷測試
生物負(fù)荷：制藥與醫(yī)材安全的關(guān)鍵角色
 
生物負(fù)荷 (Bioburden)，也稱為生菌數(shù)或負(fù)荷菌，通常指的是產(chǎn)品、原材料或表面上存在的活體微生物總數(shù)量 (如細(xì)菌、真菌、病毒等)。它能有效評估和控制產(chǎn)品的微生物含量，不僅是確保產(chǎn)品質(zhì)量的基石，更是保障患者與消費者安全的關(guān)鍵。
 
為什么生物負(fù)荷測試很重要?
 
生物負(fù)荷測試 (Bioburden testing)，又稱為生菌數(shù)測試 (total viable count, TVC) 或微生物限量(度)測試 (microbial limit testing)，是制藥與醫(yī)療產(chǎn)業(yè)中關(guān)鍵的質(zhì)量控制過程 (quality control, QC)，用于偵測及量化產(chǎn)品在滅菌前的活體微生物含量，能夠反映原料質(zhì)量、生產(chǎn)流程潔凈度、污染控制狀況，并作為制定滅菌參數(shù)及驗證滅菌效果的依據(jù)。

全球主要法規(guī)機(jī)構(gòu)，如美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織 (ISO)，都明確要求需執(zhí)行生物負(fù)荷測試。例如：
 
· ISO 11737-1：被廣泛用作醫(yī)療器材的生物負(fù)荷測試標(biāo)準(zhǔn)，并被歐盟醫(yī)療器材法規(guī) (EU MDR) 和 美國食品藥物管理局 (FDA 510 (k)) 認(rèn)可為共識標(biāo)準(zhǔn)。
· 美國藥典USP <61>, <62>, <1115>：涵蓋非無菌產(chǎn)品 (nonsterile products) 微生物限度與控制策略。
生物負(fù)荷測試被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器材、制藥、生物制劑和食品與保健品等高風(fēng)險產(chǎn)業(yè)，做為確保產(chǎn)品安全與法規(guī)合規(guī)的關(guān)鍵步驟
生物負(fù)荷測試一般在最終滅菌程序 (terminal sterilization) 前、或在無菌制程 (aseptic processing) 中「無菌過濾或充填步驟」前進(jìn)行。測試結(jié)果所反映的微生物含量，即為整體制程潔凈度的指標(biāo)。因此，生物負(fù)荷測試被視為制程潔凈驗證與污染控制策略中的關(guān)鍵步驟，其代表意義如下：
 
· 滅菌策略設(shè)定：
微生物的數(shù)量及類型會直接影響最終滅菌的有效性。如果生物負(fù)荷過高，即使按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行滅菌，也可能無法完全殺死所有微生物。因此，生物負(fù)荷水平越低，產(chǎn)品越容易滅菌。
· 質(zhì)量管理及控制：
透過定期監(jiān)測生物負(fù)荷水平能確認(rèn)制程潔凈度是否穩(wěn)定、指出制程中的破口，并且使最終產(chǎn)品的微生物含量符合規(guī)范范圍內(nèi)。
· 風(fēng)險評估：
生物負(fù)荷有助于評估產(chǎn)品對患者或消費者的潛在感染風(fēng)險。特別是醫(yī)療器材，若無法有效控制生物負(fù)荷，可能導(dǎo)致醫(yī)療相關(guān)感染 (Healthcare-associated infections, HAIs)。其特性分析有助于了解內(nèi)毒素 (endotoxin) 的存在，即使滅菌成功，部份細(xì)菌仍會釋出內(nèi)毒素，對患者健康造成潛在風(fēng)險。
· 法規(guī)要求：
許多國家和地區(qū)的法規(guī)，例如 ISO 11737-1，都要求醫(yī)療器材和藥品制造商定期進(jìn)行生物負(fù)荷測試，以符合相關(guān)的質(zhì)量和安全標(biāo)準(zhǔn)。
 
生物負(fù)荷的來源是什么? 如何控制負(fù)荷菌 (bioburden control) ?
 
微生物 (microbial) 可透過多種管道進(jìn)入產(chǎn)品或原料中。從原物料、人員、設(shè)備，乃至整個制造過程，都必須透過嚴(yán)格監(jiān)控，使滅菌程序發(fā)揮最大功效，制成使用安全無虞的產(chǎn)品。
常見的生物負(fù)荷來源及控制方式如下表所示：
 

來源	控制方式
原材料	對原材料進(jìn)行微生物檢測和控制
制造環(huán)境	維持潔凈的生產(chǎn)環(huán)境，例如：使用無塵室、空氣過濾系統(tǒng)等
人員	穿著無菌服裝，并遵守嚴(yán)格的衛(wèi)生程序
設(shè)備與工具	定期對設(shè)備和工作表面進(jìn)行徹底清潔和消毒
制造過程	遵守?zé)o菌操作規(guī)范，并選擇產(chǎn)品合適的滅菌方法

 
常見的生物負(fù)荷試驗流程及方法？
1. 收集樣品與處理：
依檢品之物理特性選用適用的前處理方式，取得待測檢液。若無適用方法，則應(yīng)建立適當(dāng)之替代序程。
 

樣品	檢液配制
水溶性檢品	以適當(dāng)緩沖液或培養(yǎng)基溶解
非油性不溶于水檢品	以適當(dāng)緩沖液或培養(yǎng)基溶解，可添加界面活性劑
油性檢品	檢品溶解于適當(dāng)酯類溶劑，再以預(yù)熱稀釋液稀釋檢品
噴霧式液體/固體檢品	將容器中檢品移入微孔濾膜過濾裝置
貼片檢品	具有黏性之面朝上放在無菌容器中，覆蓋無菌多孔材料，再將貼布移入適當(dāng)稀釋液中，振蕩至少30分鐘

 
2. 選擇適合的測試方法：
為了量化負(fù)荷菌，目前主流有四種定量分析方法，包含微孔濾膜過濾法 (Membrane Filtration Method)、傾注培養(yǎng)法 (又稱混合稀釋法，Pour Plate Method)、表面涂布法 (又稱涂抹法，Spread Plate Method) 以及多重試管法 (又稱最確數(shù)法，Most-Probable-Number, MPN)，請根據(jù)檢液特性選用適合的測試方法：
 

/	微孔濾膜過濾法(Membrane Filtration Method)	培養(yǎng)皿法 / 平板法 (Plate Count Methods)		多重試管法 (Most-Probable-Number, MPN)
		傾注平板法 (Pour Plate Method)	表面涂布法 (Spread Plate Method)
原理	檢液以 0.45 μm 濾膜過濾后，將濾紙置于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)	將檢液與未凝固之培養(yǎng)基一起倒入培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)	將檢液涂抹于培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)	將檢液進(jìn)行至少3個連續(xù)10倍之序列稀釋，進(jìn)行培養(yǎng)
適合樣品	可過濾之大量液態(tài)、生物負(fù)荷較低的樣品	無法過濾之樣品，如凝膠、黏膠物質(zhì)等	無法過濾之少量樣品	生物負(fù)荷極低的產(chǎn)品
適用熱敏感物質(zhì)	是	否	是	是
準(zhǔn)確度	高	高	高	低
培養(yǎng)時間	約 5~7 天	約 3~7 天	約 3~7 天	約 3~7 天
結(jié)果單位	菌落形成單位 (CFU)	菌落形成單位 (CFU)	菌落形成單位 (CFU)	依最確數(shù)表推估

* 一般認(rèn)為多重試管法 (MPN) 是最不準(zhǔn)確的方法，因此本法僅于無其他方法適用時才予選用。
 
3. 結(jié)果判定：
根據(jù)試驗結(jié)果判定產(chǎn)品是否符合法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，或用以評估最終滅菌所需之水平。
 
其中，微孔濾膜過濾法不僅是最常見的生物負(fù)荷檢測方法之一，也可以移除檢體中的干擾物質(zhì)。若待測樣品中含有抑制微生物的生長與繁殖的成分，如抗菌劑 (antimicrobial agent) 或其他具抑菌活性 (antibacterial activity) 的成分，可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偽陰性 (即樣品中實際存在微生物，但因生長受抑制而未被檢出)。因此，當(dāng)檢體特性適合以微孔濾膜過濾法操作時，該方法常被視為進(jìn)行生物負(fù)荷試驗的首選技術(shù)。其方法是將檢液通過 0.45 μm 的濾膜，捕捉大于孔徑的微生物，再將濾膜轉(zhuǎn)置至適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察菌落生長情形。
 
為加速過濾流程，洛科/ROCKER 提供多款真空過濾系統(tǒng) (vacuum filtration system)，皆兼容 0.45 μm 濾膜，并可搭配不銹鋼、塑料材質(zhì)漏斗，專為生物負(fù)荷測試設(shè)計。
 
生物負(fù)荷試驗最佳首選：多連真空過濾系列，提升通量及效率
 

洛科 MultiVac 301 – MB – A 多連真空過濾系統(tǒng)	洛科 SolarVac 1201 – MB – T 旋轉(zhuǎn)多連真空過濾系統(tǒng)
· 直接排水設(shè)計、省空間、省時間 · 極速拆裝設(shè)計，SS316 不銹鋼制作 · 專利旋卡緊扣設(shè)計 · 可選擇三連、六連座	· 旋轉(zhuǎn)盤設(shè)計方便操作，避免交叉污染 · 大容量 PP 真空瓶含可快速直接排廢液 · SS316 及硅膠材質(zhì)，可高溫高壓滅菌 · 可選擇六連、十二連座

 
「生物負(fù)荷試驗 」與「 無菌試驗 」的差異? 
 
生物負(fù)荷試驗 (bioburden testing) 與無菌試驗 (sterility testing) 是醫(yī)療器材和制藥行業(yè)中，確保產(chǎn)品無菌性的兩個不同但相關(guān)的測試，其目的、執(zhí)行時機(jī)和方法有所不同。
 

/	生物負(fù)荷試驗 (bioburden testing)	無菌試驗 (sterility testing)
目的	量化并監(jiān)控制程中的活體微生物總量	確定最終產(chǎn)品的無菌性
執(zhí)行時機(jī)	產(chǎn)品最終滅菌前的制程中設(shè)立檢查點	產(chǎn)品經(jīng)最終滅菌后
操作環(huán)境	一般層流柜 (laminar flow)	無菌檢測隔離器 (Isolator)
		潔凈度 Class 100 (A級)
測試方法	微孔濾膜過濾法 傾注平板法 表面涂布法 多重試管法	微孔濾膜過濾法 直接接種法
測試對象	未經(jīng)滅菌前的產(chǎn)品 非要求無菌之產(chǎn)品	最終產(chǎn)品 要求無菌之產(chǎn)品
樣器類型	藥品 (固體及液體)	藥品 (固體及液體) 醫(yī)療器材
測試結(jié)果	CFU 數(shù)值 (微生物含量)	是/否無菌
結(jié)果應(yīng)用	評估滅菌劑量和參數(shù)；微生物監(jiān)測和趨勢分析、制程風(fēng)險評估	驗證產(chǎn)品無菌性，最終放行產(chǎn)品的依據(jù)之一
標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)	ISO 11737-1 USP <61> USP <62>	ISO 11737-2 USP <71>
中華藥典	(7007.1) 微生物計數(shù)法 (7007.2) 特定微生物檢驗法	(7001) 無菌試驗法

 
總體而言，生物負(fù)荷試驗是預(yù)防性和制程控制的工具，用以了解和管理產(chǎn)品在滅菌前的微生物含量信息；而無菌試驗則是驗證性和質(zhì)量保證的工具，目的為確認(rèn)最終產(chǎn)品在經(jīng)過滅菌處理后是否符合無菌要求
 
應(yīng)用
§ 醫(yī)療器材產(chǎn)業(yè)：如手術(shù)刀片、導(dǎo)管、縫線、人工關(guān)節(jié)等
§ 制藥產(chǎn)業(yè)：無菌注射劑、藥品原料、生物制劑 (疫苗、抗體、細(xì)胞治療產(chǎn)品) 等
§ 食品產(chǎn)業(yè)：食品廠環(huán)境監(jiān)控、水樣監(jiān)測等
§ 化妝品：產(chǎn)品原料