LLC細(xì)胞的培養(yǎng)復(fù)蘇和常見問題解答
【細(xì)胞介紹】
Lewis肺癌是從C57BL小鼠的肺建立的細(xì)胞系，該小鼠帶有由原發(fā)性Lewis肺癌的移植產(chǎn)生的腫瘤。LLC細(xì)胞對(duì)1, 3-雙-（2-氯乙基）-1-亞硝基脲有抗性，但對(duì)甲氨蝶呤敏感。據(jù)報(bào)道，LLC細(xì)胞具有高度致瘤性，可以在C57BL小鼠成瘤，但在小鼠中轉(zhuǎn)移性較弱。LLC細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中形成多層，但實(shí)際上沒有融合。LLC細(xì)胞鼠痘病毒陰性，被廣泛用作轉(zhuǎn)移模型，并有助于研究癌癥化療藥物的機(jī)制。
以下是中喬新舟拍攝的LLC細(xì)胞拍攝的在不同放大倍數(shù)下的圖片：
4X
10X
20X
細(xì)胞名稱：LLC小鼠肺癌細(xì)胞
細(xì)胞別稱：LL/2 (LLC1); LL/2 (LLc1); LL/2(LLc1); LL/2; LL2; LLC1; LLC; Lewis lung carcinoma line 1; Lewis lung carcinoma; Lewis-Lung; Lewis Lung
產(chǎn)品貨號(hào)：ZQ0203
生長(zhǎng)特性：半貼半懸
培養(yǎng)條件 ：DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-100）+10%胎牛血清（中喬新舟 貨號(hào)：ZQ0500）+1%雙抗（中喬新舟 貨號(hào)：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號(hào)：ZM0203
【細(xì)胞傳代】
該細(xì)胞為半貼壁半懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞是活細(xì)胞，可用離心管收集細(xì)胞懸液后，于（125g，3～5 分鐘）1000-1200rmp 收集細(xì)胞；部分貼壁不牢的細(xì)胞可直接吹起使之懸��；貼壁較牢固的細(xì)胞可用 PBS 潤(rùn)洗后，在培養(yǎng)瓶中加入 1-2 毫升 0.25% 胰蛋白酶溶液（含 EDTA）置于 37℃培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞變圓收縮成流沙狀態(tài)脫落后可用 4-6 mL 左右完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化，輕輕吹散細(xì)胞后離心搜集細(xì)胞；將懸浮的細(xì)胞和貼壁的細(xì)胞收集到 一起混勻后按比例接種到新的培養(yǎng)瓶。
【細(xì)胞凍存】
1.細(xì)胞密度 80%以上，活細(xì)胞百分率達(dá) 95%以上時(shí)，將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2.細(xì)胞沉淀用適量 4°C 凍存液（貨號(hào)：CSP042）重懸， 建議一瓶 T25 細(xì)胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝 好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長(zhǎng)期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min， -80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
【細(xì)胞復(fù)蘇】
1.液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基，離心管。
2.凍管細(xì)胞在 37°C 水浴中迅速解凍（大約 1-2 分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之 上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3.將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含 3-6mL 完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5 分鐘）1000-1200rmp 去除培養(yǎng)基， 細(xì)胞沉淀用手指彈松，添加 3ml 完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至 0.6-2.0X105，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。建議 T25 培養(yǎng)瓶添加 5-7ml 完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá) 到 80%以上時(shí)傳代。
【常見問題】
1.培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？
1）細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2）細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過換液去除，因此每2天正常換液即可，換液前培養(yǎng)基充分預(yù)熱。
2.細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？
每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。
【發(fā)表過的文獻(xiàn)】
下面列舉了幾篇代表性的文獻(xiàn)，可以參考：
1.論文題目：B4GALT1 promotes immune escape by regulating the expression of PD-L1 at multiple levels in lung adenocarcinoma.
期刊： JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH 影響因子：11.3
2. 論文題目：Ansofaxine suppressed NSCLC progression by increasing sensitization to combination immunotherapy.
期刊：INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY 影響因子：4.8
3. 論文題目：The combination of a PTP1B inhibitor, TNFR2 blocker, and PD 1 antibody suppresses the progression of non small cell lung cancer tumors by enhancing immunocompetence.
期刊：ONCOLOGY REPORTS 影響因子：3.8
Lewis肺癌是從C57BL小鼠的肺建立的細(xì)胞系，該小鼠帶有由原發(fā)性Lewis肺癌的移植產(chǎn)生的腫瘤。LLC細(xì)胞對(duì)1, 3-雙-（2-氯乙基）-1-亞硝基脲有抗性，但對(duì)甲氨蝶呤敏感。據(jù)報(bào)道，LLC細(xì)胞具有高度致瘤性，可以在C57BL小鼠成瘤，但在小鼠中轉(zhuǎn)移性較弱。LLC細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中形成多層，但實(shí)際上沒有融合。LLC細(xì)胞鼠痘病毒陰性，被廣泛用作轉(zhuǎn)移模型，并有助于研究癌癥化療藥物的機(jī)制。
以下是中喬新舟拍攝的LLC細(xì)胞拍攝的在不同放大倍數(shù)下的圖片：
4X
10X
20X
細(xì)胞名稱：LLC小鼠肺癌細(xì)胞
細(xì)胞別稱：LL/2 (LLC1); LL/2 (LLc1); LL/2(LLc1); LL/2; LL2; LLC1; LLC; Lewis lung carcinoma line 1; Lewis lung carcinoma; Lewis-Lung; Lewis Lung
產(chǎn)品貨號(hào)：ZQ0203
生長(zhǎng)特性：半貼半懸
培養(yǎng)條件 ：DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-100）+10%胎牛血清（中喬新舟 貨號(hào)：ZQ0500）+1%雙抗（中喬新舟 貨號(hào)：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號(hào)：ZM0203
【細(xì)胞傳代】
該細(xì)胞為半貼壁半懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞是活細(xì)胞，可用離心管收集細(xì)胞懸液后，于（125g，3～5 分鐘）1000-1200rmp 收集細(xì)胞；部分貼壁不牢的細(xì)胞可直接吹起使之懸��；貼壁較牢固的細(xì)胞可用 PBS 潤(rùn)洗后，在培養(yǎng)瓶中加入 1-2 毫升 0.25% 胰蛋白酶溶液（含 EDTA）置于 37℃培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞變圓收縮成流沙狀態(tài)脫落后可用 4-6 mL 左右完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化，輕輕吹散細(xì)胞后離心搜集細(xì)胞；將懸浮的細(xì)胞和貼壁的細(xì)胞收集到 一起混勻后按比例接種到新的培養(yǎng)瓶。
【細(xì)胞凍存】
1.細(xì)胞密度 80%以上，活細(xì)胞百分率達(dá) 95%以上時(shí)，將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2.細(xì)胞沉淀用適量 4°C 凍存液（貨號(hào)：CSP042）重懸， 建議一瓶 T25 細(xì)胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝 好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長(zhǎng)期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min， -80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
【細(xì)胞復(fù)蘇】
1.液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基，離心管。
2.凍管細(xì)胞在 37°C 水浴中迅速解凍（大約 1-2 分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之 上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3.將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含 3-6mL 完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5 分鐘）1000-1200rmp 去除培養(yǎng)基， 細(xì)胞沉淀用手指彈松，添加 3ml 完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至 0.6-2.0X105，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。建議 T25 培養(yǎng)瓶添加 5-7ml 完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá) 到 80%以上時(shí)傳代。
【常見問題】
1.培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？
1）細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2）細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過換液去除，因此每2天正常換液即可，換液前培養(yǎng)基充分預(yù)熱。
2.細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？
每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。
【發(fā)表過的文獻(xiàn)】
下面列舉了幾篇代表性的文獻(xiàn)，可以參考：
1.論文題目：B4GALT1 promotes immune escape by regulating the expression of PD-L1 at multiple levels in lung adenocarcinoma.
期刊： JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH 影響因子：11.3
2. 論文題目：Ansofaxine suppressed NSCLC progression by increasing sensitization to combination immunotherapy.
期刊：INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY 影響因子：4.8
3. 論文題目：The combination of a PTP1B inhibitor, TNFR2 blocker, and PD 1 antibody suppresses the progression of non small cell lung cancer tumors by enhancing immunocompetence.
期刊：ONCOLOGY REPORTS 影響因子：3.8
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