PI、Heochst 33342/PI、Annexin V/PI三種細胞凋亡檢測方法及注意事項

PI單染色法
1、收集細胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106個/mL｝，500 ~ 1000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
2、3ml　PBS洗滌1次。
3.  離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時。
4.  離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。
5.  400目的篩網(wǎng)過濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS。
6.  用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。
7.  流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側(cè)散射光的散點圖。
8.  結(jié)果判斷：在前散射光對側(cè)散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細胞的類型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

注意事項
細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。

Heochst 33342/PI雙染色法
1、懸浮生長的細胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ，終濃度為1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2、低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液。
3.  加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4.  400目的篩網(wǎng)過濾1次。
5.  流式細胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長為352nm，發(fā)射光波波長為400 ~ 500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
6.  結(jié)果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結(jié)果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。

注意事項
1.  在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。
2.  用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。
 
Annexin V/PI雙染色法
1、細胞收集：懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細胞數(shù)為（1~5）×106，/mL　500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
2.  用孵育緩沖液洗滌1次，500~1000r/min離心5min。
3.  用100ul的標(biāo)記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10~15min。
4.  500~1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。
5.  加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。
6.  流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI。
7.  結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正�；罴毎�與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）