OptiMATE分液系統(tǒng)在密度梯度液制備流程中的應(yīng)用

腺相關(guān)病毒（AAV）

是基因治療中強(qiáng)大的遞送載體。然而，在AAV組裝時(shí)，其包裝核酸序列的效率很低，導(dǎo)致只有一小部分病毒顆粒攜帶目標(biāo)基因。富集純化這些正確組裝的病毒顆粒是下游純化工作流程中的關(guān)鍵步驟。15-60% w/v的碘克沙醇（IDX）不連續(xù)密度梯度離心是一種成熟的從細(xì)胞裂解物中純化AAV衣殼的主要方法。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，鋪設(shè)碘克沙醇不連續(xù)密度梯度是一項(xiàng)費(fèi)力的工作，并且可能因操作人員的技能水平而導(dǎo)致結(jié)果的不穩(wěn)定性。

為了應(yīng)對(duì)這一操作難題，我們開(kāi)發(fā)了這套OptiMATE全自動(dòng)密度梯度分液系統(tǒng)的自動(dòng)化解決方案。該系統(tǒng)消除了梯度液制備中的手動(dòng)步驟，包括準(zhǔn)備儲(chǔ)備試劑、分液和離心管密封。OptiMATE可運(yùn)行已建立的成熟方案，具有更高的一致性、準(zhǔn)確性和易用性。

我們列出了OptiMATE自動(dòng)化制備標(biāo)準(zhǔn)的IDX不連續(xù)梯度液的完整體系。同時(shí)，手動(dòng)鋪設(shè)了相同梯度層的梯度液，并從以下幾方面進(jìn)行對(duì)比：

• 離心管可變性；
• 梯度液折射率；
• 鋪設(shè)梯度液操作時(shí)間；
• vgs回收率。

方法

表1：用于進(jìn)行IDX對(duì)照研究的離心管溶液組分

血清型2  AAV通過(guò)三重轉(zhuǎn)染在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)后。裂解細(xì)胞并離心以去除碎片。然后，使用類似于梯度分析實(shí)驗(yàn)的15-60%（w/v）IDX不連續(xù)密度梯度液（表1，圖1）純化含有AAV的裂解澄清物。在自動(dòng)組中，使用OptiMATE將IDX不連續(xù)密度梯度液分配到39 mL聚丙烯快封管中。每個(gè)離心管中加入2.08×10¹²病毒基因組（vgs）的AAV。在手動(dòng)組中，使用OptiMATE^TM IDX制備IDX儲(chǔ)備溶液（15%、25%、40%和60%），然后使用注射器和鈍頭針頭通過(guò)底層法將每層梯度液分配到離心管中。自動(dòng)組制備的離心管在儀器上自動(dòng)進(jìn)行密封，而手動(dòng)組制備的離心管用無(wú)線熱封器手動(dòng)封口。在Optima XPN-90超速離心機(jī)中，使用Type 70 Ti轉(zhuǎn)子中于16 °C下以63,000 rpm（407,427 xg）將離心管離心2小時(shí)。離心后，通過(guò)側(cè)面穿刺提取AAV條帶（在40%-60% IDX界面處），并使用離心旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器進(jìn)行緩沖液替換。通過(guò)qPCR（AAVPro滴定試劑盒，Takara Bio）對(duì)vgs進(jìn)行定量以評(píng)估回收率。

圖1：全自動(dòng)（上）與手動(dòng)（下）配置15-60% w/v IDX不連續(xù)密度梯度液的AAV純化方案對(duì)比

結(jié)果

我們通過(guò)離心管的總重量和使用折射儀測(cè)量梯度液的折射率來(lái)進(jìn)行對(duì)比評(píng)估。測(cè)量的離心管總重量結(jié)果表明，自動(dòng)化分液和密封后,離心管之間的可變性較低（表2）。盡管手動(dòng)分配的離心管的可變性也較低，但如果操作人員技能不足，可變性可能會(huì)加劇。

圖2顯示了離心管中梯度液的密度與累積體積的關(guān)系。與手動(dòng)的IDX不連續(xù)梯度液相比，OptiMATE分配的IDX不連續(xù)梯度液具有較高的準(zhǔn)確性、更清晰的界面，并且保持在移液誤差允許的范圍內(nèi)。兩種方法中都存在一些層間擴(kuò)散，這可歸因于界面混合和分液過(guò)程引起的擴(kuò)散。

表2：手動(dòng)分液和OptiMATE自動(dòng)分液的離心管重量對(duì)比。誤差值為標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

圖2：比較OptiMATE（紅色）和手動(dòng)流程（藍(lán)色）配置的梯度液的密度曲線分布情況�；�于預(yù)期移液誤差的不同IDX層的預(yù)期密度理論曲線也被展示出來(lái)（淺灰色框）。綠色框標(biāo)記AAV衣殼在曲線上的預(yù)期位置（在40-60% w/v界面處）。誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）

圖3比較了手動(dòng)和使用OptiMATE制備離心管的時(shí)間。不考慮數(shù)學(xué)計(jì)算或方法創(chuàng)建所花費(fèi)的情況下，使用OptiMATE制備兩個(gè)39mL快封管的速度明顯比手動(dòng)快。雖然OptiMATE的總時(shí)間為31分鐘，手動(dòng)為19分鐘（多39%），但人工操作時(shí)間從手動(dòng)的31分鐘減少到OptiMATE的僅需5分鐘（減少84%），這突顯了人員時(shí)間和精力的大幅減少。隨著離心管數(shù)量的增加，手動(dòng)鋪設(shè)和自動(dòng)鋪設(shè)之間的時(shí)間差異將進(jìn)一步擴(kuò)大，這也再一次凸顯了OptiMATE系統(tǒng)并行分配和密封離心管的優(yōu)勢(shì)。

圖3：使用OptiMATE或手動(dòng)鋪設(shè)兩根39毫升快封管的IDX不連續(xù)密度梯度液示意圖。制備步驟為淺灰色，分液和密封步驟為深灰色

為了評(píng)估AAV純化效率，從離心管中回收含有AAV2樣品的條帶，使用qPCR分析條帶中填充衣殼的含量（表3）。兩種純化方法回收的AAV量相差不大，并且與IDX不連續(xù)梯度液純化的預(yù)期值匹配。由于該純化的主要目標(biāo)是在初步純化步驟中將AAV2衣殼與細(xì)胞雜質(zhì)分離，而不是區(qū)分空衣殼和完整衣殼，因此我們僅專注于比較vgs的回收率。

表3：純化回收后的AAV2的qPCR分析結(jié)果

結(jié)論

OptiMATE可精確分配不連續(xù)梯度液，解決了密度梯度超速離心中的兩個(gè)主要挑戰(zhàn)：勞動(dòng)強(qiáng)度和一致性。

• 梯度液的一致密度分布和純化后AAV2 vgs的回收率共同證明了這一點(diǎn)。
• 操作界面簡(jiǎn)潔方便搭配自動(dòng)化和精確性的使用流程，即使是新用戶也能快速輕松的進(jìn)行樣品純化。
• 設(shè)置和操作更加快速簡(jiǎn)化了整個(gè)工作流程，同時(shí)降低了操作人員接觸化學(xué)和生物材料的風(fēng)險(xiǎn)。
• 此外，該儀器可無(wú)縫集成到現(xiàn)有的純化過(guò)程中，降低了鋪設(shè)高質(zhì)量不連續(xù)密度梯度液的門(mén)檻，并提高了整體流程的效率。