《Science Advances》文獻成果：單波長激發(fā)三光子成像信號增強10倍
該研究由Yusaku Hontani、Fei Xia和Chris Xu等人合作完成，發(fā)表于《Science Advances》，題為《Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain》。研究團隊來自康奈爾大學應用與工程物理系及生物醫(yī)學工程系，長期致力于多光子顯微鏡技術(shù)的創(chuàng)新與應用。
重要發(fā)現(xiàn)
01傳統(tǒng)多光子成像的技術(shù)瓶頸與突破方向
多光子熒光顯微鏡通過長波長光子的非線性激發(fā)實現(xiàn)深層成像，其中雙光子顯微鏡（2PM）和三光子顯微鏡（3PM）是主流技術(shù)。與2PM相比，3PM憑借更長的激發(fā)波長（如1300nm和1700nm）和更高的非線性限制，在深層組織（如小鼠腦海馬區(qū)）中具有更強的穿透能力和圖像對比度。
然而，傳統(tǒng)3PM的多色成像面臨核心挑戰(zhàn)：不同顏色熒光分子（如綠色和紅色）的激發(fā)光譜差異大，需依賴雙波長（如1300nm和1700nm）分別激發(fā)，導致光學系統(tǒng)復雜、總激發(fā)功率高，且信號強度因三階非線性效應較弱而受限。
02藍移激發(fā)：單波長多色成像的關(guān)鍵機制研究團隊發(fā)現(xiàn)，紅色熒光分子（如Texas Red、DsRed）的三光子激發(fā)光譜峰值可相對于其一光子激發(fā)光譜峰值發(fā)生藍移（短波長偏移）數(shù)百納米。傳統(tǒng)3PM中，1700nm激發(fā)對應紅色熒光分子的最低電子激發(fā)態(tài)（如590nm一光子吸收峰），而在1300nm波段激發(fā)時，光子能量可驅(qū)動分子躍遷到更高能量激發(fā)態(tài)（如430nm附近的吸收帶）。
這一藍移激發(fā)機制帶來兩大突破：
（1）單波長兼容多色熒光：使用1340nm單一波長，即可同時激發(fā)綠色熒光分子（如GCaMP6s）至最低激發(fā)態(tài)（對應1300nm光學窗口的傳統(tǒng)路徑），以及紅色熒光分子至更高激發(fā)態(tài)，實現(xiàn)綠色（525nm發(fā)射）、紅色（617nm發(fā)射）熒光的同步采集。
（2）信號強度顯著增強：在1300nm波段，部分紅色熒光分子（如Texas Red、SR 101）的三光子激發(fā)截面比傳統(tǒng)1700nm波段提升10倍以上。例如，Texas Red 在1340nm處的三光子截面達～11×10⁻⁸²cm⁶(s/photons)²，而1700nm處僅為～0.56×10⁻⁸²cm⁶(s/photons)²，信號強度提升約20倍。
PrismPlus轉(zhuǎn)基因小鼠在1340nm激發(fā)下熒光蛋白的多色3P熒光圖像
03小鼠腦內(nèi)深層多色成像的實驗驗證穿透深度與信噪比（SBR）
在小鼠腦內(nèi)1150μm深度（海馬區(qū)），1340nm激發(fā)的SBR達47，分別是1220nm雙光子激發(fā)（SBR=0.77）的60倍和1700nm傳統(tǒng)三光子激發(fā)（SBR=16）的3倍，接近無背景噪聲的理想成像狀態(tài)。
多色成像能力
利用1340nm單波長，成功同時成像GCaMP6s標記的神經(jīng)元（綠色）、Texas Red標記的血管（紅色）及三次諧波生成（THG，藍色），深度達1200μm；在PrismPlus轉(zhuǎn)基因小鼠中，進一步實現(xiàn)Cerulean（青色）、EGFP（綠色）、YFP（黃色）、DsRed-Max（紅色）四色熒光的同步采集，驗證了技術(shù)的普適性。
光穩(wěn)定性提升
對比SR101在1340nm和1700nm激發(fā)下的光漂白速率，前者的熒光衰減速度降低約50%，表明藍移激發(fā)可減少長期成像中的光損傷。
體內(nèi)小鼠大腦中Texas Red標記血管的多光子圖像
創(chuàng)新與亮點
01突破多色成像的技術(shù)壁壘
傳統(tǒng)多光子成像中，多色熒光需依賴雙波長激光源、復雜光路切換及功率疊加，不僅增加實驗成本，還可能因光毒性限制成像時長。本研究通過單波長激發(fā)兼容多色熒光分子，無需額外光學組件即可實現(xiàn)綠色、紅色甚至四色熒光的同步采集，簡化了系統(tǒng)復雜度，為實時動態(tài)觀測細胞間相互作用提供了可能。
藍移激發(fā)不僅拓展了熒光分子的激發(fā)路徑，更通過共振增強效應顯著提升三光子截面。例如，當激發(fā)波長接近紅色熒光分子二光子激發(fā)光譜的長波邊緣（如1340nm接近2×670nm），量子擾動理論預測的共振效應可使激發(fā)概率大幅增加。這一機制在保持1300nm波段深穿透能力的同時，將信號強度提升至傳統(tǒng)3PM的10倍以上，突破了長期困擾深層成像的“信號-損傷”平衡難題。
03推動神經(jīng)科學研究的范式變革
該技術(shù)首次實現(xiàn)了小鼠腦內(nèi)深層（超1000μm）的多色動態(tài)成像，可同步記錄神經(jīng)元活動（GCaMP6s鈣信號）、血管結(jié)構(gòu)（TexasRed標記）及膠質(zhì)細胞（SR101標記）。例如，在750μm深度成功捕捉到清醒小鼠神經(jīng)元的自發(fā)鈣振蕩，為研究大腦網(wǎng)絡的跨尺度動態(tài)提供了前所未有的工具。
總結(jié)與展望
多光子熒光顯微鏡技術(shù)的革新始終圍繞“更深、更亮、更精準”的目標。該研究通過藍移激發(fā)機制，將單波長多色成像與深層穿透能力結(jié)合，不僅解決了傳統(tǒng)3PM的技術(shù)瓶頸，更開辟了熒光分子激發(fā)的新維度——無需依賴新型熒光蛋白或復雜合成，即可通過現(xiàn)有分子的高階激發(fā)態(tài)實現(xiàn)性能躍升。未來該技術(shù)有望在以下方向拓展，結(jié)合光纖探針或微型化顯微鏡，實現(xiàn)自由活動動物的腦內(nèi)動態(tài)多色成像，推動神經(jīng)環(huán)路功能研究。與光遺傳學、電生理記錄等技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建“結(jié)構(gòu)-功能-調(diào)控”一體化的研究平臺�；谒{移激發(fā)原理，系統(tǒng)性篩選具有高激發(fā)截面的熒光分子，進一步優(yōu)化成像信噪比。
從實驗室到應用，單波長三光子顯微鏡正以其創(chuàng)新性和實用性，為探索生命奧秘打開一扇更明亮的“光學窗口”。隨著技術(shù)的普及，我們有望在不久的將來，更清晰地解碼大腦神經(jīng)網(wǎng)絡的動態(tài)圖譜，乃至實時觀測腫瘤微環(huán)境、器官發(fā)育等復雜生物學過程。
論文信息聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Hontani Y, Xia F, Xu C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Sci Adv. 2021 Mar 17;7(12):eabf3531.
DOI:10.1126/sciadv.abf3531.
