細(xì)胞凍存步驟及凍存原代細(xì)胞的培養(yǎng)

瀏覽次數(shù)：559　發(fā)布日期：2023-9-19　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

原代細(xì)胞(primary culture cell)是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等。

一、細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 制備凍存液，凍存液比例：本實(shí)驗(yàn)室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO，不同實(shí)驗(yàn)室及不同細(xì)胞可能略有差異，也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，對(duì)其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計(jì)數(shù)；

3. 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入對(duì)應(yīng)的凍存液，使細(xì)胞密度維持在300-500w/mL；

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液，擰緊蓋管，做好標(biāo)記。

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過(guò)夜；

6. 若沒(méi)有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過(guò)夜，注意轉(zhuǎn)移過(guò)程中要保冷，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存。

二、凍存原代細(xì)胞的培養(yǎng)：

1.將一管細(xì)胞從液氮罐中取出，注意保護(hù)手和眼睛。

2.將凍存管快速的放入37℃水浴中，輕輕握住并旋轉(zhuǎn)，直到管內(nèi)物體*融化。

3.將凍存管立即從水浴中拿出，擦干，轉(zhuǎn)入無(wú)菌環(huán)境。

4.用70%的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精。

5.打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋(注意，由于凍存管有負(fù)壓，開蓋時(shí)可能會(huì)有少量溢出，這是正�，F(xiàn)象)。

6.用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個(gè)細(xì)胞。

7.蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻。若需要?dú)怏w交換可打開蓋子。

8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中。

9.放入培養(yǎng)箱后第6-16小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞楓和未貼壁的細(xì)胞。

三、原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)法：

1.組織塊接種后的前3天，在觀察和移動(dòng)的過(guò)程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng)，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。

2.加入的培養(yǎng)液不宜過(guò)多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來(lái)。

3.當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來(lái)后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。

4.為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

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