細(xì)胞爬片全過程操作詳解
在做免疫熒光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測（TUNEL）時，免不了要制備細(xì)胞爬片，爬片質(zhì)量決定了最后拍照的質(zhì)量以及實驗數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。細(xì)胞爬片就是讓玻片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在玻片上生長。主要用于組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細(xì)胞涂片，原位雜交等。
一、細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備：
1、蓋玻片的選擇：
爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細(xì)胞爬片（價格比較昂貴）但是細(xì)胞貼壁牢固，拍出照片效果好；
2、爬片的剪裁：
可根據(jù)自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時做幾個指標(biāo)的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；
3、爬片的使用前處理：
將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干，備用�？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。
4、多聚賴氨酸的使用：
很多人都將玻片用此處理，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細(xì)胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。
二、細(xì)胞爬片的操作：
1、胰酶消化細(xì)胞后計數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。
2、加細(xì)胞前，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。(整個過程注意無菌操作)
3、根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度接入培養(yǎng)板內(nèi)即可。
4、待細(xì)胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。
5、按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞爬片的固定：
另外在保存細(xì)胞爬片的時候，一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。
細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當(dāng)然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細(xì)胞在洗的過程中有可能會脫落。
然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。
四、細(xì)胞進行爬片注意事項：
一、細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備：
1、蓋玻片的選擇：
爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細(xì)胞爬片（價格比較昂貴）但是細(xì)胞貼壁牢固，拍出照片效果好；
2、爬片的剪裁：
可根據(jù)自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時做幾個指標(biāo)的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；
3、爬片的使用前處理：
將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干，備用�？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。
4、多聚賴氨酸的使用：
很多人都將玻片用此處理，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細(xì)胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。
二、細(xì)胞爬片的操作：
1、胰酶消化細(xì)胞后計數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。
2、加細(xì)胞前，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。(整個過程注意無菌操作)
3、根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度接入培養(yǎng)板內(nèi)即可。
4、待細(xì)胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。
5、按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞爬片的固定：
另外在保存細(xì)胞爬片的時候，一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。
細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當(dāng)然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細(xì)胞在洗的過程中有可能會脫落。
然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。
四、細(xì)胞進行爬片注意事項：
1. 使用細(xì)胞爬片時（比如在六孔板中放入爬片，六孔板的孔底面積往往會比爬片面積多出一部分，加細(xì)胞懸液時常常就是細(xì)胞鋪滿整個孔底，有時細(xì)胞生長邊集現(xiàn)象，就是靠近壁邊緣密度要高些，這樣處于中央玻片上爬的細(xì)胞數(shù)量就可能相對較少）。比較好的做法是將玻片放入孔板的孔內(nèi)后，加細(xì)胞懸液時只滴到玻片上，一直滴到液體布滿整個玻片又不會溢出玻片邊緣。
2. 按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片。注意細(xì)胞不能太密，否則容易掉片。
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