不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力研究
包括干細胞在內(nèi)的細胞治療產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細胞市場包括上中游的干細胞存儲制備以及下游的臨床應(yīng)用。
為了使細胞產(chǎn)品成功應(yīng)用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的治療可用方法。為了避免細胞內(nèi)結(jié)冰對細胞結(jié)構(gòu)的損害，一些生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑已經(jīng)上市。常用的生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。
然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患。此外，DMSO具有細胞毒性。據(jù)報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應(yīng)的報道。此外，已知DMSO會通過調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導(dǎo)致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的生物制劑凍干保護劑，細胞冷凍保護劑。
海藻糖生物制劑凍干保護劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在完全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護劑不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質(zhì)干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞(hESCs) 和人類誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSCs) 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進入細胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導(dǎo)致細胞損傷。
該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復(fù)蘇，對幾個關(guān)鍵參數(shù)進行了治療研究，包括細胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。
1. 不同冷凍保護劑組成
所有冷凍保護劑均現(xiàn)用現(xiàn)配，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。實驗中用到的細胞均使用CS10冷凍保存。CS10是一種無血清，無動物源成分，含有10% DMSO，推薦用于人類多能干細胞(hPSCs)的冷凍保護劑。
2. 細胞的冷凍保存及解凍
細胞在特定條件下培養(yǎng)，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細胞在每種冷凍保護劑1.5 mL中重懸，然后轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉(zhuǎn)移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團消失，細胞懸液用溫暖的培養(yǎng)基稀釋。以200g離心3分鐘收集細胞，并以指定的接種量將其接種到適合每種細胞類型的包被培養(yǎng)容器上。
3. 結(jié)果與討論
①細胞活力
解凍48 h后，用阿拉瑪藍法測定細胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨使用時的適宜用量。在不同干細胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細胞復(fù)蘇后的活力并與對照組進行比對。結(jié)果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細胞類型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護劑配方（詳見上文），對三種干細胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進行冷凍保存及復(fù)蘇，進行細胞冷凍復(fù)蘇后活力檢測。并將細胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細胞在相同條件下進行比較。
當細胞海藻糖(冷凍保護劑A組)冷凍保存時，解凍后的細胞恢復(fù)率降低，不同干細胞類型的細胞恢復(fù)率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護劑C組、D組)，RC17和AF22細胞的細胞存活率都達到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細胞存活率優(yōu)于乙二醇。
此外，對比由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實驗結(jié)果，可以確認細胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結(jié)果。
這些結(jié)果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可提高海藻糖冷凍保護劑的存活率。與對照組CS10相比，細胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細胞過早分化的風險。
②細胞形態(tài)
干細胞凍存另一個重點關(guān)注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細胞內(nèi)外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進而誘導(dǎo)染色體異常分離，導(dǎo)致細胞生長特征和形態(tài)變化。因此，可通過觀察凍存復(fù)蘇后的細胞形態(tài)來較為直觀地評估干細胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細胞形態(tài)。相位對比圖像證實，在所有細胞系中，海藻糖復(fù)合冷凍保護劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細胞形態(tài)與CS10中保存的細胞相同。
③標志物表達水平
為了確認凍存復(fù)蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標記物的表達水平。
對RC17和CTR2#6細胞檢測細胞標記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進行比對。
對AF22細胞檢測細胞標記Nestin和Sox2。與對照組進行比對。結(jié)果顯示干細胞分化潛能未受影響。
④染色體穩(wěn)定性
為了評估海藻糖冷凍保護劑對干細胞染色體穩(wěn)定性的影響，對所有三種干細胞系進行常規(guī)核型分型和aCGH，下圖為AF22細胞系儲存前后的結(jié)果。
總體而言核型保持穩(wěn)定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細胞群中，另一些可能是在細胞體外操作過程中隨機產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導(dǎo)致，因為在儲存前(圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結(jié)構(gòu)染色體畸變。
⑤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細胞響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR通路的能力產(chǎn)生負面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，ER整合了各種分子和細胞信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR都介導(dǎo)影響細胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機制。
總體而言，與對照組CS10相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR反應(yīng)水平適中。一種更敏感的細胞系是CTR2#6，在實驗組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。
為了使細胞產(chǎn)品成功應(yīng)用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的治療可用方法。為了避免細胞內(nèi)結(jié)冰對細胞結(jié)構(gòu)的損害，一些生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑已經(jīng)上市。常用的生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。
然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患。此外，DMSO具有細胞毒性。據(jù)報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應(yīng)的報道。此外，已知DMSO會通過調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導(dǎo)致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的生物制劑凍干保護劑，細胞冷凍保護劑。
海藻糖生物制劑凍干保護劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在完全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護劑不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質(zhì)干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞(hESCs) 和人類誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSCs) 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進入細胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導(dǎo)致細胞損傷。
該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復(fù)蘇，對幾個關(guān)鍵參數(shù)進行了治療研究，包括細胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。
1. 不同冷凍保護劑組成
| 組別 | 成分 |
| A | 0.5M 海藻糖 |
| B | 0.5M 海藻糖+2.5% 乙二醇 |
| C | 0.5M 海藻糖+10% 乙二醇 |
| D | 0.5M 海藻糖+10% 甘油 |
2. 細胞的冷凍保存及解凍
細胞在特定條件下培養(yǎng)，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細胞在每種冷凍保護劑1.5 mL中重懸，然后轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉(zhuǎn)移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團消失，細胞懸液用溫暖的培養(yǎng)基稀釋。以200g離心3分鐘收集細胞，并以指定的接種量將其接種到適合每種細胞類型的包被培養(yǎng)容器上。
3. 結(jié)果與討論
①細胞活力
解凍48 h后，用阿拉瑪藍法測定細胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨使用時的適宜用量。在不同干細胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細胞復(fù)蘇后的活力并與對照組進行比對。結(jié)果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細胞類型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護劑配方（詳見上文），對三種干細胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進行冷凍保存及復(fù)蘇，進行細胞冷凍復(fù)蘇后活力檢測。并將細胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細胞在相同條件下進行比較。
當細胞海藻糖(冷凍保護劑A組)冷凍保存時，解凍后的細胞恢復(fù)率降低，不同干細胞類型的細胞恢復(fù)率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護劑C組、D組)，RC17和AF22細胞的細胞存活率都達到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細胞存活率優(yōu)于乙二醇。
此外，對比由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實驗結(jié)果，可以確認細胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結(jié)果。
這些結(jié)果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可提高海藻糖冷凍保護劑的存活率。與對照組CS10相比，細胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細胞過早分化的風險。
②細胞形態(tài)
干細胞凍存另一個重點關(guān)注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細胞內(nèi)外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進而誘導(dǎo)染色體異常分離，導(dǎo)致細胞生長特征和形態(tài)變化。因此，可通過觀察凍存復(fù)蘇后的細胞形態(tài)來較為直觀地評估干細胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細胞形態(tài)。相位對比圖像證實，在所有細胞系中，海藻糖復(fù)合冷凍保護劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細胞形態(tài)與CS10中保存的細胞相同。
③標志物表達水平
為了確認凍存復(fù)蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標記物的表達水平。
對RC17和CTR2#6細胞檢測細胞標記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進行比對。
對AF22細胞檢測細胞標記Nestin和Sox2。與對照組進行比對。結(jié)果顯示干細胞分化潛能未受影響。
④染色體穩(wěn)定性
為了評估海藻糖冷凍保護劑對干細胞染色體穩(wěn)定性的影響，對所有三種干細胞系進行常規(guī)核型分型和aCGH，下圖為AF22細胞系儲存前后的結(jié)果。
總體而言核型保持穩(wěn)定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細胞群中，另一些可能是在細胞體外操作過程中隨機產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導(dǎo)致，因為在儲存前(圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結(jié)構(gòu)染色體畸變。
⑤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細胞響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR通路的能力產(chǎn)生負面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，ER整合了各種分子和細胞信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR都介導(dǎo)影響細胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機制。
總體而言，與對照組CS10相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR反應(yīng)水平適中。一種更敏感的細胞系是CTR2#6，在實驗組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。
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