酶切連接等五種常規(guī)分子克隆技術(shù)介紹

對于做過分子實(shí)驗(yàn)的小伙伴來說，傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)——酶切連接大家應(yīng)該都是比較熟悉的，那么對于其他的分子克隆技術(shù)類型大家有了解過嗎？根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，來選擇不同的分子克隆技術(shù)以及產(chǎn)品。本期，大家和小編一起來了解下幾種常規(guī)的分子克隆技術(shù)吧。

一、酶切連接

酶切連接法屬于經(jīng)典的分子克隆方法，利用限制性內(nèi)切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA，最后轉(zhuǎn)化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。‘’

圖1 酶切連接流程

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實(shí)驗(yàn)圓滿完成的必要條件。限制性內(nèi)切酶能特異性地結(jié)合于能被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否有修飾酶活性,可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三類。分子克隆技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶,切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。粘性末端，即限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈上交錯(cuò)切割，形成的核苷酸順序互補(bǔ)的，可形成氫鍵的末端（見圖2）。平齊末端，限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷（見圖3）。

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

愛必信擁有目前常用的如快速內(nèi)切酶BsaI（abs60206）、快速內(nèi)切酶ClaI（abs60209）、快速內(nèi)切酶EcoRI（abs60213）、快速內(nèi)切酶HindIII（abs60217）等在內(nèi)的四十多款限制性內(nèi)切酶。

核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。DNA接酶催化雙鏈DNA子中相鄰堿基的5’-P末端與3-0H間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被稱為生物界的“502”。在有Mg2+和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5´-磷酸末端和3´-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈 DNA、RNA或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻，但不能催化單鏈DNA之間的連接。

圖4 T4 DNA連接酶作用位點(diǎn)

二、TA克隆

TA克隆是指把PCR片段與一個(gè)具有3‘-T突出的載體DNA連接起來的方法。可用于不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片段通常需要通過TA克隆的方法重組到T-載體中，通過測序測定DNA序列。愛必信T-Vector快速克隆試劑盒（abs60085）是高效、便利的PCR產(chǎn)物克隆專用試劑盒。

愛必信T-Vector快速克隆試劑盒（abs60085）產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、陽性率高：高純度酶切型線性T載體，連接效率更高，藍(lán)斑率低于10% 。
2、方便快捷：預(yù)混連接反應(yīng)體系，最快5分鐘實(shí)現(xiàn)連接，無需純化，直接轉(zhuǎn)化。
3、T Simple載體無常用酶切位點(diǎn)，利于含酶切位點(diǎn)基因克隆。
4、無NdeI或NcoI位點(diǎn)，便于重組表達(dá)基因的克隆。
5、提供純化的PCR片段作為陽性質(zhì)控對照 。
6、 藍(lán)白篩選：高表達(dá)活性的β-半乳糖苷酶，顯色更快更深 。
7、批次穩(wěn)定：遵循標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測。

圖5 TA克隆流程

三、無縫克隆

無縫克隆技術(shù)是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。愛必信快速多片段DNA組裝預(yù)混液（abs60250）就是基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，它不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25 nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

愛必信快速多片段DNA組裝預(yù)混液（abs60250）特點(diǎn)：

1.簡單便捷：兼容PCR產(chǎn)物體系與載體酶切體系，省去繁瑣的純化步驟；

2.高陽性率：定向克隆單個(gè)DNA片段至載體上，陽性率高于95%；

3.快速反應(yīng)：反應(yīng)時(shí)間大大縮短，最快僅需5min。

4.單片段、多片段均可連接：單個(gè)或多個(gè)片段同時(shí)插入，省去重復(fù)純化與酶切過程。

圖6 愛必信快速多片段DNA組裝預(yù)混液（abs60250）無縫克隆操作流程

四、TOPO克隆

TOPO克隆實(shí)際是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆技術(shù)，關(guān)鍵是拓?fù)洚悩?gòu)酶。該技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的極其簡便快捷的方法。

五、Geteway克隆

Geteway克隆利用位點(diǎn)特異重組實(shí)現(xiàn)目的片段的插入的，載體上的一段目的片段在重組酶的作用下會(huì)替換成目的片段，不依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶，導(dǎo)入目的基因不需要開環(huán)處理，載體需要用試劑盒提供的載體，一般需要用到兩個(gè)載體，快速、高效將DNA序列轉(zhuǎn)移到載體上的克隆。