貼壁細胞傳代培養(yǎng)流程介紹

細胞傳代培養(yǎng)流程圖
 

傳代流程：
1. 取出預熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。
2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意培養(yǎng)瓶取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。
3. 將培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺后打開瓶口，同時要在酒精燈上燒口消毒。
4. 加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。
5. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。
6. 棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液終止反應。小心吹打成細胞懸液。
7. 將細胞懸液吸入10 ml離心管中。平衡后將離心管放入離心機中，以1000 rpm/min離心5 min。
8. 棄去上清液，加入適當體積的培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
9. 將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
10. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。最后要做好標記。
11. 繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2-4 h后開始貼附在瓶壁上。

注意事項：
1、嚴格的無菌操作。
2、貼壁細胞消化適度：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
3、傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作，每種細胞使用一套器材。避免交叉感染。
4、傳代細胞瓶口每次打開或者關閉都需要在酒精燈上消毒。