匯總RT-PCR需注意的細(xì)節(jié)

RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription PCR）或者稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行 DNA擴(kuò)增。

RT-PCR需注意的細(xì)節(jié)

1. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須戴口罩、手套，盡量避免其他人員干擾。

2. RT試劑盒從冰箱拿出，應(yīng)該充分解凍，瞬離后，混勻，放于冰上，可在冰上加樣。試劑可以用數(shù)字貼紙編號(hào)，避免漏加、錯(cuò)加試劑。

3. 取用不同的試劑時(shí)，必須更換槍頭，樣本之間要避免交叉污染。

4. 逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，PCR儀可以先預(yù)熱。

5. 反應(yīng)體系配好之后，應(yīng)充分混勻，瞬離，并且彈去管內(nèi)的氣泡。

6. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)預(yù)防RNA酶污染，使用無(wú)酶槍頭以及EP管，同時(shí)臺(tái)面可以使用固相RNA酶去除劑清潔。

7. PCR時(shí)，管壁盡量避免寫(xiě)字。

8. 管蓋一定要蓋嚴(yán)。

9. 10μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系建議加入不超過(guò)500ng的RNA。

10. 如果目的基因表達(dá)量非常低,最多加入1μg Total RNA,否則加入RNA量過(guò)高,可能會(huì)超出后續(xù)PCR的線性范圍。

11. 反應(yīng)體積可根據(jù)需要等比例放大。

12. 試劑盡量不要反復(fù)凍融。

13. 每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔,所有成分加完后，離心去除氣泡。

14. 可將所有共同物質(zhì)加入同一管中，混勻后分散入其他管中。