定量PCR操作過(guò)程中的注意事項(xiàng)

在定量PCR（也稱(chēng)rt-PCR或qPCR）中，熒光信號(hào)是由熒光探針或熒光DNA結(jié)合染料（如SYBR Green）產(chǎn)生，其強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物分子（擴(kuò)增子）的數(shù)量成正比。每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，收集熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)將熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖，qPCR儀生成擴(kuò)增曲線(xiàn)，其表示在整個(gè)PCR過(guò)程中產(chǎn)物的累積，通過(guò)這個(gè)過(guò)程，即可實(shí)現(xiàn)量化。如果樣品中特定的序列（DNA或RNA）豐富，則在較早的循環(huán)中觀(guān)察到擴(kuò)增，Ct值小;如果序列稀少，則在稍后的循環(huán)中觀(guān)察到擴(kuò)增，Ct值大。此SOP將涵蓋總RNA提取和兩步法逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（qRT PCR）的操作過(guò)程以及數(shù)據(jù)分析。
    
 注意事項(xiàng)：
1. 所有步驟均應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，超凈臺(tái)紫外照射至少15min。
2. 所有試劑應(yīng)為此實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用。
3. 使用75％乙醇或其他去污劑擦拭工作臺(tái)，避免表面污染。
4. 進(jìn)入熒光定量PCR 操作實(shí)驗(yàn)室后需要佩戴一次性無(wú)菌口罩、無(wú)菌乳膠手套、實(shí)驗(yàn)中盡量避免與同事交談，防止PCR 模板污染。
5. 實(shí)驗(yàn)中使用各種規(guī)格的離心管，槍頭及配制試劑和溶解沉淀用的水，均應(yīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。
6. 使用Trizol試劑時(shí)，避免接觸皮膚或衣服。避免吸入蒸氣。
7. qPCR反應(yīng)需要qPCR級(jí)水，試劑和試管。請(qǐng)務(wù)必使用正確類(lèi)型的qPCR光學(xué)PCR管和蓋子。不可用普通的PCR管。
8. 加樣前，先布局，規(guī)劃加樣順序以避免交叉污染。
9. 所有實(shí)驗(yàn)應(yīng)均應(yīng)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照，其中包含除DNA或cDNA樣品以外的所有反應(yīng)組分。
10. 先配制qPCR反應(yīng)混合液，減少誤差。
11. 加樣后上機(jī)前，務(wù)必通過(guò)瞬離將反應(yīng)液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)干擾熒光檢測(cè)且降低酶活性，從而降低擴(kuò)增效率。