FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)應(yīng)用案例（第四期）
FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)應(yīng)用案例（第四期）
——FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用
FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)作為最早實用化的葉綠素熒光成像技術(shù)，是目前世界上最權(quán)威、使用范圍最廣、種類最全面、發(fā)表論文最多的葉綠素熒光成像技術(shù)。FluorCam已經(jīng)發(fā)展出十幾個型號，涵蓋了從葉綠體、單個細胞、微藻到葉片、果實、花朵，乃至整株植物和植物灌層，幾乎可以測量所有的植物樣品，甚至包括含有葉綠素的微生物和動物。易科泰Ecolab生態(tài)實驗室總結(jié)了FluorCam相關(guān)SCI參考文獻近500篇，可聯(lián)系Ecolab生態(tài)實驗室（eco-lab@eco-tech.com.cn, info@eco-lab.cn）索取文獻目錄及全文。
了解FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)詳情請點擊以下鏈接：
FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)
FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)最早在21世紀初引進到國內(nèi)，但一直到2010年后國內(nèi)的科學(xué)家才在國際交流中逐漸發(fā)現(xiàn)這項技術(shù)的巨大價值，在短短數(shù)年中也利用這一技術(shù)發(fā)表了幾十篇高水平SCI文獻。本期主要介紹目前FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用情況。
一、 植物光合生理研究
葉綠素熒光可以直接反應(yīng)植物光系統(tǒng)的生理狀況，因此從葉綠素熒光技術(shù)發(fā)明之初，就被用于各種植物光合生理研究。
山東農(nóng)科院使用FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)研究了小麥旗葉與外露花梗光合能力的差異[1]。研究中發(fā)現(xiàn)在小麥生長前中期，旗葉與外露花梗的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII基本相同。但在生長后期，旗葉的光合能力顯著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗葉（圖1）。這證明了在生長后期的灌漿期，花梗對維持籽粒的生長更為重要。
之后，他們又研究了小麥葉片和穎片季節(jié)衰老過程中以及穎果發(fā)育過程中光合特性的變化[2；3，圖2]。
二、 植物生/非生物逆境脅迫與抗性研究
由于幾乎所有種類的生物/非生物逆境脅迫都會影響到植物光合系統(tǒng)的正常生理功能，而葉綠素熒光技術(shù)是公認的植物逆境光合功能研究最靈敏的無損探針。因此通過FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)不但能反映植物受脅迫程度和抗逆能力的差異，而且能指明脅迫影響光合系統(tǒng)的具體機理過程。
1. 養(yǎng)分虧缺
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，施加氮肥使兩個品種的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實際功能活性更有作用。同時玉米品種HZ4熒光參數(shù)的升高幅度也要高于Q319，這應(yīng)該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米（圖3）。
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究發(fā)現(xiàn)S-adenosyl-L-methionine (SAM)基因過表達會顯著增加在堿脅迫下的番茄的光合能力[5]（圖4）。
山東農(nóng)科院研究了不同灌溉方式對小麥光合特性的影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)比起傳統(tǒng)的漫灌，溝灌條件下的小麥葉片有更高的最大光化學(xué)效率Fv/Fm、量子產(chǎn)額ΦPSII、光化學(xué)淬滅qP和更低的非光化學(xué)淬滅NPQ（圖5）。這說明溝灌給小麥提供了更好的土壤水分條件，從而使小麥葉片擁有了更強的光化學(xué)活性。
三、 植物光合基因組學(xué)與分子生研究
植物光合作用可以說是植物對人類乃至整個生物圈最重要的功能，一方面為其他生物直接或間接地提供能量和食物，另一方面也在地球碳氧循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此，對植物光合作用功能基因的研究，一直是植物基因組學(xué)與分子生物學(xué)研究的重中之重。而葉綠素熒光能直接反映相關(guān)功能基因的表型變化，所以幾乎所有與光合基因相關(guān)的研究都要用葉綠素熒光技術(shù)來進行表型篩選、基因功能驗證等方面的工作。
1. 從光合表型到基因功能表型到基因功能
中國科學(xué)院植物研究所張立新研究員是最早將FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)引入國內(nèi)的科學(xué)家。中科院植物所光生物學(xué)重點實驗室是國內(nèi)植物光合基因相關(guān)研究最前沿的科研單位。FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)引入后就立刻用于了光合相關(guān)基因功能與表型研究。
2006年，張立新研究團隊就使用FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)研究了擬南芥ppt1突變體光系統(tǒng)II光化學(xué)能力的變化，進而證明了磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白對維持葉片生長后期正常光合作用的重要性[11]（圖6）。
之后，植物所張立新團隊和彭連偉團隊都使用FluorCam發(fā)表了多篇植物光合基因相關(guān)文獻[12；13]。
彭連偉在研究NADH脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定性時[14]，發(fā)現(xiàn)在50μmol photons /m².s的光強下，lhca5 lhca6 pgr5、lhca6 pgr5和crr4-2 pgr5擬南芥突變體都產(chǎn)生了生長阻滯，并表現(xiàn)出了高葉綠素熒光（圖7A，B）。這表明了這些突變體的光合電子傳遞活性和NDH活性都受到了抑制。進一步分析不同光強下的ΦPSII，野生型、lhca5和lhca6突變體的ΦPSII水平是相近的，這表明Lhca5和Lhca6在光合電子傳遞中都不是必需的（圖7C）。而lhca6 pgr5和lhca5 lhca6 pgr5的ΦPSII水平則顯著降低，通過其他結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)這是由于在低光照條件下，這些突變體的PSI就受到了光抑制并出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)。
在后續(xù)的研究中，彭連偉團隊還使用FluorCam發(fā)現(xiàn)了NdhV亞基對NADH脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定性的重要作用[15]。其團隊的張琳博士利用 FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)，從 T-DNA插入或EMS誘變的擬南芥突變體庫中篩選光合電子傳遞調(diào)控的突變體，并重點研究了bfa3的功能，相關(guān)結(jié)果于 2016 年 4 月發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊Plant Physiology[16]。憑借這一科研發(fā)現(xiàn)，張琳博士榮獲易科泰FluorCam葉綠素熒光成像優(yōu)秀論文一等獎。
國內(nèi)另一個應(yīng)用FluorCam技術(shù)進行光合基因研究較為出色的單位是西北農(nóng)林科技大學(xué)。他們引進儀器技術(shù)雖然較晚，但在購置FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統(tǒng)后很快就發(fā)表了2篇高水平文章，研究了多個關(guān)于擬南芥葉綠體發(fā)育和葉片顏色相關(guān)的基因功能[17；18]（圖8）。
上海生命科學(xué)研究院青年研究組長、博士生導(dǎo)師Chanhong Kim在蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院、康奈爾大學(xué)博伊斯湯普森研究所工作期間就已經(jīng)使用FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)進行了大量的研究工作并在PNAS、Plant Cell發(fā)表多篇相關(guān)文獻。2014年，Chanhong Kim到上海生命科學(xué)研究院工作后立刻購置了一臺FluorCam封閉式葉綠素熒光/GFP成像系統(tǒng)。他用這一系統(tǒng)一方面進行GFP表達植株的快速篩選（圖9），另一方面進行單線態(tài)氧和EXECUTER1介導(dǎo)信號在基粒中發(fā)生過程的研究，這一最新研究成果發(fā)表同樣在2016年P(guān)NAS上[19]。
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)也使用FluorCam技術(shù)開展了大白菜生長緩慢、類囊體減少的突變體光和特性的研究[20]。
2. 從基因功能到光合表型
在有的研究中，光合基因功能是通過其他方法基本上確定的。但這個基因表達出的表型是否符合預(yù)期，還是必須通過FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)進行光合表型方面的驗證。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司EcoLab生態(tài)實驗室合作，從黃瓜中克隆了紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因（CsVDE），再將這一基因的反義片段轉(zhuǎn)基因到擬南芥中[21]。發(fā)現(xiàn)在高光脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素熒光參數(shù)非光化學(xué)淬滅（NPQ）比野生型顯著降低，這證明了CsVDE在葉黃素循環(huán)和PSII光抑制敏感性上的重要作用（圖10）。
由于FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)引進到國內(nèi)的時間較晚，國內(nèi)科學(xué)家對這一技術(shù)的運用程度還低于歐美同行。因此，很多國內(nèi)的科學(xué)家目前是與國際上的知名科研院所開展合作，使用FluorCam進行研究工作并發(fā)表文章。比如浙江大學(xué)與德國康斯坦茨大學(xué)合作發(fā)表的使用FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)（此系統(tǒng)應(yīng)用了FluorCam顯微成像技術(shù)，康斯坦茨大學(xué)Kupper教授和PSI公司合作完善了這一技術(shù)，是國際上對這一技術(shù)應(yīng)用最前沿的學(xué)者）研究了銅對海州香薷Elsholtzia splendens光合系統(tǒng)的毒害作用[22]；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)與德國洪堡大學(xué)等單位合作研究了病毒介導(dǎo)的豌豆基因沉默對四吡咯生物合成、葉綠體發(fā)育等造成的影響[23]；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)與捷克科學(xué)院等單位合作研究的芽單胞菌門含有葉綠體的稀有細菌的光合特性和相關(guān)基因研究[24；25]；江蘇農(nóng)科院與英國諾丁漢大學(xué)合作研究的兩種病原菌對不同小麥品系的侵害性[26]等。
——FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用
FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)作為最早實用化的葉綠素熒光成像技術(shù)，是目前世界上最權(quán)威、使用范圍最廣、種類最全面、發(fā)表論文最多的葉綠素熒光成像技術(shù)。FluorCam已經(jīng)發(fā)展出十幾個型號，涵蓋了從葉綠體、單個細胞、微藻到葉片、果實、花朵，乃至整株植物和植物灌層，幾乎可以測量所有的植物樣品，甚至包括含有葉綠素的微生物和動物。易科泰Ecolab生態(tài)實驗室總結(jié)了FluorCam相關(guān)SCI參考文獻近500篇，可聯(lián)系Ecolab生態(tài)實驗室（eco-lab@eco-tech.com.cn, info@eco-lab.cn）索取文獻目錄及全文。
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FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)最早在21世紀初引進到國內(nèi)，但一直到2010年后國內(nèi)的科學(xué)家才在國際交流中逐漸發(fā)現(xiàn)這項技術(shù)的巨大價值，在短短數(shù)年中也利用這一技術(shù)發(fā)表了幾十篇高水平SCI文獻。本期主要介紹目前FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用情況。
一、 植物光合生理研究葉綠素熒光可以直接反應(yīng)植物光系統(tǒng)的生理狀況，因此從葉綠素熒光技術(shù)發(fā)明之初，就被用于各種植物光合生理研究。
山東農(nóng)科院使用FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)研究了小麥旗葉與外露花梗光合能力的差異[1]。研究中發(fā)現(xiàn)在小麥生長前中期，旗葉與外露花梗的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII基本相同。但在生長后期，旗葉的光合能力顯著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗葉（圖1）。這證明了在生長后期的灌漿期，花梗對維持籽粒的生長更為重要。
之后，他們又研究了小麥葉片和穎片季節(jié)衰老過程中以及穎果發(fā)育過程中光合特性的變化[2；3，圖2]。
二、 植物生/非生物逆境脅迫與抗性研究
由于幾乎所有種類的生物/非生物逆境脅迫都會影響到植物光合系統(tǒng)的正常生理功能，而葉綠素熒光技術(shù)是公認的植物逆境光合功能研究最靈敏的無損探針。因此通過FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)不但能反映植物受脅迫程度和抗逆能力的差異，而且能指明脅迫影響光合系統(tǒng)的具體機理過程。
1. 養(yǎng)分虧缺
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，施加氮肥使兩個品種的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實際功能活性更有作用。同時玉米品種HZ4熒光參數(shù)的升高幅度也要高于Q319，這應(yīng)該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米（圖3）。
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究發(fā)現(xiàn)S-adenosyl-L-methionine (SAM)基因過表達會顯著增加在堿脅迫下的番茄的光合能力[5]（圖4）。
山東農(nóng)科院研究了不同灌溉方式對小麥光合特性的影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)比起傳統(tǒng)的漫灌，溝灌條件下的小麥葉片有更高的最大光化學(xué)效率Fv/Fm、量子產(chǎn)額ΦPSII、光化學(xué)淬滅qP和更低的非光化學(xué)淬滅NPQ（圖5）。這說明溝灌給小麥提供了更好的土壤水分條件，從而使小麥葉片擁有了更強的光化學(xué)活性。
三、 植物光合基因組學(xué)與分子生研究
植物光合作用可以說是植物對人類乃至整個生物圈最重要的功能，一方面為其他生物直接或間接地提供能量和食物，另一方面也在地球碳氧循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此，對植物光合作用功能基因的研究，一直是植物基因組學(xué)與分子生物學(xué)研究的重中之重。而葉綠素熒光能直接反映相關(guān)功能基因的表型變化，所以幾乎所有與光合基因相關(guān)的研究都要用葉綠素熒光技術(shù)來進行表型篩選、基因功能驗證等方面的工作。
1. 從光合表型到基因功能表型到基因功能
中國科學(xué)院植物研究所張立新研究員是最早將FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)引入國內(nèi)的科學(xué)家。中科院植物所光生物學(xué)重點實驗室是國內(nèi)植物光合基因相關(guān)研究最前沿的科研單位。FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)引入后就立刻用于了光合相關(guān)基因功能與表型研究。
2006年，張立新研究團隊就使用FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)研究了擬南芥ppt1突變體光系統(tǒng)II光化學(xué)能力的變化，進而證明了磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白對維持葉片生長后期正常光合作用的重要性[11]（圖6）。
之后，植物所張立新團隊和彭連偉團隊都使用FluorCam發(fā)表了多篇植物光合基因相關(guān)文獻[12；13]。
彭連偉在研究NADH脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定性時[14]，發(fā)現(xiàn)在50μmol photons /m².s的光強下，lhca5 lhca6 pgr5、lhca6 pgr5和crr4-2 pgr5擬南芥突變體都產(chǎn)生了生長阻滯，并表現(xiàn)出了高葉綠素熒光（圖7A，B）。這表明了這些突變體的光合電子傳遞活性和NDH活性都受到了抑制。進一步分析不同光強下的ΦPSII，野生型、lhca5和lhca6突變體的ΦPSII水平是相近的，這表明Lhca5和Lhca6在光合電子傳遞中都不是必需的（圖7C）。而lhca6 pgr5和lhca5 lhca6 pgr5的ΦPSII水平則顯著降低，通過其他結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)這是由于在低光照條件下，這些突變體的PSI就受到了光抑制并出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)。
在后續(xù)的研究中，彭連偉團隊還使用FluorCam發(fā)現(xiàn)了NdhV亞基對NADH脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定性的重要作用[15]。其團隊的張琳博士利用 FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)，從 T-DNA插入或EMS誘變的擬南芥突變體庫中篩選光合電子傳遞調(diào)控的突變體，并重點研究了bfa3的功能，相關(guān)結(jié)果于 2016 年 4 月發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊Plant Physiology[16]。憑借這一科研發(fā)現(xiàn)，張琳博士榮獲易科泰FluorCam葉綠素熒光成像優(yōu)秀論文一等獎。
國內(nèi)另一個應(yīng)用FluorCam技術(shù)進行光合基因研究較為出色的單位是西北農(nóng)林科技大學(xué)。他們引進儀器技術(shù)雖然較晚，但在購置FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統(tǒng)后很快就發(fā)表了2篇高水平文章，研究了多個關(guān)于擬南芥葉綠體發(fā)育和葉片顏色相關(guān)的基因功能[17；18]（圖8）。
上海生命科學(xué)研究院青年研究組長、博士生導(dǎo)師Chanhong Kim在蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院、康奈爾大學(xué)博伊斯湯普森研究所工作期間就已經(jīng)使用FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)進行了大量的研究工作并在PNAS、Plant Cell發(fā)表多篇相關(guān)文獻。2014年，Chanhong Kim到上海生命科學(xué)研究院工作后立刻購置了一臺FluorCam封閉式葉綠素熒光/GFP成像系統(tǒng)。他用這一系統(tǒng)一方面進行GFP表達植株的快速篩選（圖9），另一方面進行單線態(tài)氧和EXECUTER1介導(dǎo)信號在基粒中發(fā)生過程的研究，這一最新研究成果發(fā)表同樣在2016年P(guān)NAS上[19]。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)也使用FluorCam技術(shù)開展了大白菜生長緩慢、類囊體減少的突變體光和特性的研究[20]。
2. 從基因功能到光合表型
在有的研究中，光合基因功能是通過其他方法基本上確定的。但這個基因表達出的表型是否符合預(yù)期，還是必須通過FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)進行光合表型方面的驗證。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司EcoLab生態(tài)實驗室合作，從黃瓜中克隆了紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因（CsVDE），再將這一基因的反義片段轉(zhuǎn)基因到擬南芥中[21]。發(fā)現(xiàn)在高光脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素熒光參數(shù)非光化學(xué)淬滅（NPQ）比野生型顯著降低，這證明了CsVDE在葉黃素循環(huán)和PSII光抑制敏感性上的重要作用（圖10）。
由于FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)引進到國內(nèi)的時間較晚，國內(nèi)科學(xué)家對這一技術(shù)的運用程度還低于歐美同行。因此，很多國內(nèi)的科學(xué)家目前是與國際上的知名科研院所開展合作，使用FluorCam進行研究工作并發(fā)表文章。比如浙江大學(xué)與德國康斯坦茨大學(xué)合作發(fā)表的使用FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)（此系統(tǒng)應(yīng)用了FluorCam顯微成像技術(shù)，康斯坦茨大學(xué)Kupper教授和PSI公司合作完善了這一技術(shù)，是國際上對這一技術(shù)應(yīng)用最前沿的學(xué)者）研究了銅對海州香薷Elsholtzia splendens光合系統(tǒng)的毒害作用[22]；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)與德國洪堡大學(xué)等單位合作研究了病毒介導(dǎo)的豌豆基因沉默對四吡咯生物合成、葉綠體發(fā)育等造成的影響[23]；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)與捷克科學(xué)院等單位合作研究的芽單胞菌門含有葉綠體的稀有細菌的光合特性和相關(guān)基因研究[24；25]；江蘇農(nóng)科院與英國諾丁漢大學(xué)合作研究的兩種病原菌對不同小麥品系的侵害性[26]等。
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