生物芯片技術(shù)在藥物R&D中的應(yīng)用

1946年世界上第一臺電子數(shù)字計算機(jī)ENIAC在美國Pennsylvania大學(xué)問。在隨后的50年里，以美國的硅谷為搖籃，計算機(jī)技術(shù)不斷飛速發(fā)展，給我們的生活帶來了巨大的變革。無獨有偶，1991年又是在美國硅谷，Affymax公司開始了生物芯片的研制，他們將芯片光刻技術(shù)與光化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合制作了寡核苷酸陣列芯片。近年來，以DNA芯片為代表的生物芯片技術(shù)，得到了迅猛發(fā)展，已有多種不同功能的生物芯片問世。目前生物芯片技術(shù)已應(yīng)用于分子生物學(xué)、疾病的預(yù)防、診斷和治療、新藥開發(fā)、生物武器的研制、司法鑒定、環(huán)境污染監(jiān)測和食品衛(wèi)生監(jiān)督等諸多領(lǐng)域，已成為各國學(xué)術(shù)界和工業(yè)界所矚目并研究的一個熱點。

　　生物芯片的概念源自于計算機(jī)芯片，狹義的生物芯片即微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白質(zhì)微陣列和小分子化合物微陣列。分析的基本單位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以點陣方式固定的一系列可尋址的識別分子，點陣中每一個點都可以視為一個傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測物進(jìn)行反應(yīng)，其結(jié)果利用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法。同位素法或電化學(xué)法顯示，再用掃描儀等儀器記錄，最后通過專門的計算機(jī)軟件進(jìn)行分析。廣義的生物芯片是指能對生物成分或生物分子進(jìn)行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件，其主要種類有微陣列芯片、過濾分離芯片、介電電泳分離芯片、生化反應(yīng)芯片和毛細(xì)管電泳芯片等。

　　隨著21世紀(jì)的到來，制藥公司正面臨著一次嚴(yán)峻的市場挑戰(zhàn)。這些公司為了保持或增強(qiáng)在市場上的競爭力，不得不尋求發(fā)展新的藥物開發(fā)技術(shù)以提高藥物發(fā)現(xiàn)的速度，縮短新藥上市的時間，減少藥物開發(fā)的成本。近年來生物芯片技術(shù)的飛速發(fā)展，引起了制藥業(yè)的極大興趣，使得生物芯片技術(shù)在藥物研究與開發(fā)領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用，已逐漸滲入到藥物研發(fā)過程中的各個步驟。本文將主要討論生物芯片技術(shù)在藥物靶點發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究、超高通量藥物篩選、毒理學(xué)研究、藥物基因組學(xué)研究以及藥物分析中的應(yīng)用。

1 生物芯片在藥物靶點發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究中的應(yīng)用
　　藥物靶點發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究是生物芯片技術(shù)在藥物研發(fā)中應(yīng)用最為廣泛的一個領(lǐng)域。在藥物靶點發(fā)現(xiàn)和藥物作用機(jī)制研究中所使用的生物芯片主要是指DNA芯片。在DNA芯片的表面，以微陣列的方式固定有寡核苷酸或cDNA。使用DNA 芯片可以對研究者感興趣的基因或生物體整個基因組的基因表達(dá)進(jìn)行測定。在當(dāng)代藥物開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)和選擇合適的藥物靶點是藥物開發(fā)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成的關(guān)鍵因素之一。人體是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，疾病的發(fā)生和發(fā)展必然牽涉到網(wǎng)絡(luò)中的諸多環(huán)節(jié)。當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的心腦血管疾病、惡性腫瘤、老年性癡呆癥和一些代謝紊亂疾病都是多因素作用的結(jié)果，往往不能歸結(jié)于單一因素的變化。應(yīng)用一些基因?qū)ふ也呗匀鏒D PCR等雖然為發(fā)現(xiàn)新的功能基因提供了一些線索，但還是有相當(dāng)?shù)木窒扌�。而DNA芯片可以從疾病及藥物2個角度對生物體的多個參量同時進(jìn)行研究以發(fā)掘藥物靶點并同時獲取大量其他相關(guān)信息。因此可以說，在這種情況下，任何一元化的分析方法均不及 DNA芯片這種集成化的分析手段更具有優(yōu)勢。

DNA芯片在藥物靶點發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究中的應(yīng)用具體表現(xiàn)在以下幾個方面。

1 比較正常不同組織細(xì)胞中基因的表達(dá)模式:
　　基因的表達(dá)模式給它的功能提供了間接的信息。例如只在腎臟中表達(dá)的基因就不大可能與精神分裂癥有關(guān)。一些藥物的靶點是在整個身體中分布廣泛的蛋白質(zhì)，這類藥物的不良反應(yīng)往往比較大。而選擇只在特異組織中才表達(dá)的蛋白作為藥物篩選的靶點，可以減少藥物對整體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，因而更引起人們的關(guān)注。例如骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）與破骨細(xì)胞（osteoclasts）的功能有關(guān)，破骨細(xì)胞可以破壞并吸收骨質(zhì)，當(dāng)骨質(zhì)的形成與破壞出現(xiàn)不平衡的時候，就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。如果破骨細(xì)胞的功能得到抑制，那么就可以控制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。利用已有的人類EST序列和DNA芯片技術(shù)，可以容易地得到只在破骨細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的基因如 cathepsink基因，它編碼半胱氨酸蛋白酶。以 cathepsink基因作為靶標(biāo)，篩選對它有抑制作用的藥物，就有可能得到治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。但是這種方法也有其局限性，它只能得到mRNA水平的表達(dá)譜，另外組織一般由多種細(xì)胞組成，而要將這些細(xì)胞分離很困難。

2 研究正常組織與病理組織基因表達(dá)差異
　　正常組織在病變的過程中，往往伴隨著基因表達(dá)模式的變化。基因表達(dá)水平的升高或降低，可能是病變的原因，也可能是病變的結(jié)果。若基因表達(dá)的變化是病變的原因，則以此基因為靶點的藥物就可能逆轉(zhuǎn)病變；若基因表達(dá)的變化是病變的結(jié)果，則以此基因為靶點的藥物就可能減輕病變的癥狀。DNA芯片技術(shù)可以在病理組織與正常組織之間一次比較成千上萬個基因的表達(dá)變化，找出病理組織中表達(dá)異常的基因。Heller等提取正常及誘發(fā)病變的巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞系、原代軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的 mRNA，用包含細(xì)胞因子、趨化因子、DNA結(jié)合蛋白及基質(zhì)降解金屬蛋白酶等幾大類基因的cDNA芯片進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了數(shù)種變化明顯的基因。其中除了有已知與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有關(guān)的TNF，IL－1，IL－6，IL－ 8，G－CSF，RANTES，VCAM的基因外，還有編碼基質(zhì)金屬彈性蛋白酶HME，IL-3，ICE，趨化因子Groα 等的基因。而以前認(rèn)為金屬彈性蛋白酶只存在于肺泡巨噬細(xì)胞和胎盤細(xì)胞中。彈性蛋白酶可以破壞膠原纖維及組織基底膜層，它在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理組織中的出現(xiàn)，為治療該病提供了新的藥物靶點。
　　利用DNA芯片來尋找疾病相關(guān)基因的策略尤其適用于病因復(fù)雜的情況。例如，惡性腫瘤的發(fā)生常常是多基因共同作用的結(jié)果，DNA芯片技術(shù)在腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)模式及腫瘤相關(guān)基因發(fā)掘中具有重要的作用。Wang等將一些看家基因、細(xì)胞因子及受體基因、細(xì)胞分裂相關(guān)基因及其他一些癌基因共5766個基因的cDNA探針固定在芯片上，對正常卵巢組織及卵巢癌組織的mRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者之間30％基因表達(dá)相差2倍以上，9％相差3倍以上，其中上調(diào)較為明顯的有CD9．上皮糖蛋白（ep ithelial glycoprotein）、p27及HE蛋白激酶抑制物等。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步證實了以前用其他方法獲得的結(jié)果，還提供了一些新的信息。再如，Kapp 等用包含950個DNA探針的DNA芯片分析比較霍奇金病細(xì)胞系L428及KMH2與EB病毒永生化的B淋巴細(xì)胞系LGL－GK的基因表達(dá)港，發(fā)現(xiàn)霍奇金病源的細(xì)胞系中白細(xì)胞介素-13（IL－13）及白細(xì)胞介素-5（IL－5）表達(dá)異常增高；用IL－13抗體處理霍奇金病源的細(xì)胞系可顯著抑制其增殖。此發(fā)現(xiàn)提示，IL-13可能以自分泌形式促進(jìn)霍奇金病相關(guān)細(xì)胞增殖。IL-13及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能成為霍奇金病治療及藥物篩選的新靶點。

3 建立模式生物細(xì)胞中的基因表達(dá)模型
　　采用模式生物細(xì)胞進(jìn)行試驗，條件容易控制，對模式生物基因表達(dá)的研究將啟發(fā)人們發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)新的藥物作用靶點。目前，已有多種模式生物（如酵母）的基因組計劃已經(jīng)完成。釀酒酵母（saccharomvces cerevisi ae）就是一種可用來進(jìn)行藥物篩選的較為理想的模式生物。它是真核生物而且基因組已全部測序，細(xì)胞繁殖快，易于培養(yǎng)，與哺乳動物細(xì)胞有許多共同的生化機(jī)制。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在酵母細(xì)胞中存在許多與人類疾病相關(guān)的基因。如人類Werner''''s綜合征表現(xiàn)出早熟的特征，其細(xì)胞的生活周期變短。人類與此疾病相關(guān)的基因與酵母中編碼DNA解旋酶的 SGS1基因極為相似。Botstein等得到了SGS1基因突變的酵母菌株，此突變菌株生活周期變短，細(xì)胞的表型特征與患有Werner''''s綜合征入細(xì)胞相似。已有一些研究小組根據(jù)公布的酵母基因組序列，用PCR方法擴(kuò)增了酵母6000多個開放閱讀框（open reading frame，ORF）片段，制成DNA芯片，在整個基因組的范圍內(nèi)對酵母的基因表達(dá)進(jìn)行檢測。

4 建立病原作基因的表達(dá)模型
　　由于病原體的基因組規(guī)模相對較小，可用包含其全部基因的DNA 芯片鑒定那些對人產(chǎn)生毒害作用的基因。異煙肼（isoniazid，INH）是治療肺結(jié)核的常用藥物，其治療結(jié)核病的機(jī)制是它阻斷了分枝茵酸的生物合成途徑。Wilson等根據(jù)已測序的肺結(jié)核桿菌基因組序列，用PCR方法擴(kuò)增了3834個ORF（占全部 ORF的97％），固化在玻片上，制成檢測肺結(jié)核桿菌基因表達(dá)的DNA芯片。用INH處理敏感菌株，發(fā)現(xiàn)除了生化途徑已清楚的與分枝菌酸合成相關(guān)的一些基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化外，還發(fā)現(xiàn)EfpA基因的表達(dá)也被誘導(dǎo)發(fā)生了變化，推測EfpA基因也參與了分枝菌酸的生物合成，而EfpA基因只在分枝菌屬中一些致病的種類中才存在，故EfpA基因可以作為治療結(jié)核病的新靶點。另外，分別用INH和 Ethionamide處理敏感菌株，獲得了相似的基因表達(dá)譜，證實了兩者具有相同的作用機(jī)制。

5 研究藥物處理細(xì)胞后基因未達(dá)變化
　　藥物與細(xì)胞（特別是敏感細(xì)胞）相互作用，將引起細(xì)胞外部形態(tài)及內(nèi)部正常代謝過程的一系列變化。其內(nèi)部生理活動的變化可集中表現(xiàn)在其基因表達(dá)的變化上。通過測定分析藥物對細(xì)胞的基因表達(dá)的影響，可推測藥物的作用機(jī)制，評價藥物活性及毒性，進(jìn)而確證藥物靶點或者發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點。通過DNA芯片測定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞基因表達(dá)變化來進(jìn)行藥物篩選與研究，對那些用常規(guī)方法很難追蹤監(jiān)測的藥物或需要很長時間才能得到藥物臨床實驗結(jié)果時，顯得尤為有用。
　　通過監(jiān)測陽性藥物處理前后組織細(xì)胞基因表達(dá)變化情況可以獲得許多十分有價值的信息。首先，經(jīng)藥物處理后表達(dá)明顯改變的基因往往與發(fā)病過程及藥物作用途徑密切相關(guān)，很可能是藥物作用的靶點或繼發(fā)事件，可作為進(jìn)一步藥物篩選的靶點或?qū)σ延械陌悬c進(jìn)行驗證；其次，藥物處理后基因表達(dá)的改變對藥物作用機(jī)制研究有一定的提示作用。
　　理論上講，藥物作用誘導(dǎo)的細(xì)胞基因表達(dá)變化應(yīng)與缺失編碼該藥物作用靶點的基因引起的基因表達(dá)變化相似。Marton等使用含有6065個釀酒酵母的ORF的DNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，由免疫抑制劑 FK506誘導(dǎo)的的基因表達(dá)變化在缺失編碼被 FK506抑制的蛋白的基因變種中未觀察到，但在缺失與FK506作用無關(guān)的基因變種中卻視察到了。于是推測FK506除了與親免蛋白（immunophilins）結(jié)合外還有其他被忽略的作用靶（off－target）。在實驗基礎(chǔ)上，他們提出了所謂的解碼器戰(zhàn)略（decoder strategy），即首先比較經(jīng)過藥物作用的野生株和缺失某些基因的變種株的基因表達(dá)譜，若二者相似，則將這種變種挑選出來，并將其與藥物作用。如果突變基因所編碼的蛋白質(zhì)參與的生物途徑受藥物的影響，則藥物誘導(dǎo)該變種的基因表達(dá)變化與藥物誘導(dǎo)野生株基因表達(dá)變化將不同。用這種策略不僅可以確證藥物作用靶，還可以發(fā)現(xiàn)未曾引起人們注意的作用靶，并可從這些被忽略掉的靶中推測藥物的毒副作用。Cyclin依賴型激酶（cyclin－dependent kinas es，CDKs）在細(xì)胞增殖中有著重要的作用，是一種抗腫瘤藥物的靶點。Gray等從2，6，9，-三取代嘌呤化合物庫中篩選CDKs的抑制劑。他們將體外有活性的2種化合物flavopiridol和52（化合物代號）與酵母作用，然后用共含有260000個長度為25個堿基的一組寡聚核苷酸芯片檢測酵母基因表達(dá)變化。試驗結(jié)果表明，幾乎所有的已知與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。雖然flavopiridol和52體外活性相似，但他們引起的酵母基因表達(dá)的變化卻有顯著的差異，表明二者對酵母的作用途徑是不一樣的。
　　鬼臼亞乙苷（etoposide）是p53活化拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅱ的抑制劑，在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang 等經(jīng)用鬼臼亞已苷作用人成骨肉瘤細(xì)胞系U2－ OS后，根據(jù)不同的時間間隔分別提取細(xì)胞mRNA，用寡核苷酸芯片測定6591條mRNA表達(dá)百的變化，發(fā)現(xiàn)62條mRNA表達(dá)縣有變化。通過選取其中12條基因做進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)有2條是已知的 p53調(diào)控基因（WAF1／p21和PCNA），有兩條是新的p53靶基因，其余的與p53無關(guān)。在實驗基礎(chǔ)上，他們提出了介導(dǎo)鬼臼亞乙苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)途徑。此項研究工作使人們又多獲得一種抗腫痛藥物的靶點。
　　應(yīng)用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物的作用靶點。如給酵母某一特定的呈單倍體狀態(tài)的基因?qū)��?yīng)的位置上放置一個遺傳標(biāo)記，該標(biāo)記可被DNA芯片所識別，那么通過比較藥物作用前后用芯片檢測整個文庫的結(jié)果，便有可能獲得藥物作用的靶基因。研究者稱此種篩選方式為 haploinsufficiency drug screen。
　　用DNA微陣列芯片進(jìn)行藥物研究還存在如下一些缺點：①由于雜交樣品制備復(fù)雜，采用DNA微陣列芯片很難實現(xiàn)高通量。②DNA微陣列芯片只能用于檢測已知序列的基因。③由于靈敏度的限制，采用現(xiàn)存的DNA微陣列芯片難以檢測到表達(dá)水平很低的基因。
　　除了DNA芯片外，組織芯片、蛋白質(zhì)芯片和細(xì)胞芯片也在藥物研究中嶄露頭角。最近，耶魯大學(xué)的研究小組首次報道了真核生物蛋白質(zhì)組水平的蛋白質(zhì)微陣列芯片。他們表達(dá)和純化了酵母的 5800種蛋白質(zhì)，并將這些蛋白質(zhì)點樣固定在載玻片上，制作了酵母蛋白質(zhì)組微陣列芯片。他們使用這種芯片篩選能與特定蛋白質(zhì)和磷脂相互作用蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了新的能與鈣調(diào)蛋白和磷脂相互作用的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)微陣列芯片可以用于篩選與蛋白質(zhì)相互作用的藥物，還可以用于檢測蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。他們的研究成果證實了制作和使用蛋白質(zhì)組微陣列芯片進(jìn)行功能分析檢測的可行性，并向人們預(yù)示了蛋白質(zhì)微陣列芯片在藥物開發(fā)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。
Zlauddin和Sabatinl發(fā)明了一種細(xì)胞微陣列芯片。他們首先將不同的質(zhì)粒DNA點在玻璃片上，做成質(zhì)粒DNA做陣列芯片。接著用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理該質(zhì)粒DNA微陣列芯片，然后在處理好的質(zhì)粒DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞。點在芯片上的質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)染試劑的幫助下原位轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，在質(zhì)粒DNA微陣列的每一個質(zhì)粒樣品點的相同位置形成了轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的細(xì)胞群。細(xì)胞因獲得了外源DNA而獲得了新的性狀。這樣，由質(zhì)粒DNA芯片制成了由不同性狀細(xì)胞組成的細(xì)胞做陣列芯片。他們嘗試用這種細(xì)胞芯片來確證藥物作用靶點，尋找能改變細(xì)胞生理狀態(tài)的基因產(chǎn)物。這種新型細(xì)胞芯片可以用來在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高通量篩選有可能成為候選先導(dǎo)分子的化合物、蛋白質(zhì)或寡核苷酸。在功能基因組研究和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

　　2 生物芯片作為超高通量篩選平臺的應(yīng)用
　　在過去的十幾年里，隨著科學(xué)的進(jìn)步以及在巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，藥物篩選技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。在80年代中期（高通量篩選形成之初），每天只能篩選30種化合物，到90年代中期，每天可篩選1，500種化合物，而如今每天可篩選超過 100，000個化合物。高速、低成本的高通量篩選已成為當(dāng)今藥物篩選的主流，并逐漸向超高通量方向發(fā)展。在過去的幾年中，世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術(shù)為核心的中小型生物科技公司結(jié)盟或合作，采用高通量或超高通量藥物篩選技術(shù)進(jìn)行先導(dǎo)物分子的篩選。要進(jìn)一步提高篩選率，高通量篩選技術(shù)的各個方面均需要技術(shù)創(chuàng)新，這為生物芯片技術(shù)進(jìn)入藥物篩選領(lǐng)域提供了寶貴的契機(jī)。
　　提高藥物篩選的通量，實現(xiàn)超高通量篩選有2 條途徑：一是微型化，一是自動化。生物芯片作為一種新型技術(shù)平臺，正可滿足超高通量篩選微型化和自動化的需要。生物芯片技術(shù)應(yīng)用于超高通量篩選有2個發(fā)展方向：一是微孔板/微陣列技術(shù)，一是微流體芯片技術(shù)。
　　微孔板/微陳列技術(shù)
　　微孔板技術(shù)的發(fā)展主要表現(xiàn)在板孔數(shù)的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等報道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系統(tǒng)，以金屬蛋白酶為靶，對組合及分離純化的化合物庫進(jìn)行篩選的結(jié)果。雖然隨著材料科學(xué)和加工技術(shù)的發(fā)展，微孔板技術(shù)有了長足的進(jìn)步，但其發(fā)展面臨著一些不易解決的困難，主要有：微量液體極易蒸發(fā)，不適于那些不能用二甲亞砜（DMSO）作溶劑的篩選方法以及受限于當(dāng)今還不夠完善的微量液體分配技術(shù)。
　　微陣列技術(shù)是將微孔板技術(shù)進(jìn)一步微型化。最近，哈佛大學(xué)的研究人員開發(fā)了化合物微陣列芯片，主要用于篩選能與特定蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的化合物。他們將玻片表面進(jìn)行化學(xué)處理，使其衍生化產(chǎn)生活性基團(tuán)，然后將溶于有機(jī)溶劑中的化合物用機(jī)械手點在經(jīng)處理的玻片表面，化合物與玻片表面的活性基團(tuán)反應(yīng)而被固定于玻片表面，這樣就將不同的化合物排布成微陣列，固定在玻片表面，制成化合物微陣列芯片。隨后將感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后與微陣列芯片上的化合物反應(yīng)，經(jīng)清洗后，再進(jìn)行熒光檢測就可以篩到能與這種蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的化合物。他們用化合物微陣列芯片進(jìn)行了原理性實驗，其結(jié)果表明，使用這種化合物微陣列芯片可以并行、快速地進(jìn)行大規(guī)模的化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合篩選。他們最先是將玻璃片表面進(jìn)行馬來酰亞胺衍生化處理，后來采用亞硫酰氯處理，都獲得了成功。他們還嘗試了使用這種化合物微陣列芯片進(jìn)行大規(guī)模對映異構(gòu)體的分型檢測。加利福尼亞大學(xué)Davis分校的科學(xué)家們采用類似的方法也制造了一種化合物微陣列芯片。他們對玻琥載玻片表面進(jìn)行氨基化處理，在氨基玻片上進(jìn)行乙醛酰衍生化，然后將帶有連接臂的配體分子點在修飾過的玻片表面。在進(jìn)行化學(xué)連接反應(yīng)之后，這種固定了不同小分子配體的微陣列芯片被用來進(jìn)行了3種生物學(xué)檢測：蛋白質(zhì)結(jié)合檢測、功能磷酸化檢測和活細(xì)胞粘附檢測。實驗結(jié)果證實了化合物微陣列芯片可以幫助我們對由組合合成方法獲得的大量化合物進(jìn)行快速的功能分析和篩選�；�合物微陣列芯片技術(shù)與基于微珠體的固相組合會成技術(shù)相結(jié)合為高通量藥物篩選帶來了一條新的途徑，將對高通量藥物篩選技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生積極的影響。
　　最近，出現(xiàn)了一種被稱為芯片膜片鉗（patch-on- a－chip）的新技術(shù)。在這種膜片鉗芯片上加工有檢測電信號的點陣，點陣中的每一個點是一個電信號記錄單元，同時每個點底部與負(fù)歷相通，可以吸位細(xì)胞。這樣膜片鉗芯片上的每一個點就可以實現(xiàn)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的功能。膜片鉗芯片具有操作簡單、快速和可實現(xiàn)高通量等優(yōu)點，可以用于電生理研究和高通量藥物篩選。位于美國圣地亞哥的AVIVA公司正在致力于此項技術(shù)的開發(fā)。

微流體芯片技術(shù)
　　微流體裝置的發(fā)展已廣泛用于生化及細(xì)胞的分析。鑒于這項技術(shù)在超高通量篩選中的巨大應(yīng)用前景，吸引了眾多學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的實驗室對該項技術(shù)的研究與開發(fā)。借用半導(dǎo)體工業(yè)中所用的光刻技術(shù)將內(nèi)徑在10～100μm的做通道加工在玻璃或硅片中，利用電動泵和流體的壓力來控制皮、納升級液體的流動。該技術(shù)可減少幾個數(shù)量級的試劑消耗量，并能提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。它所采用的并行樣品處理程序可以獲得更高的篩選通量。多種類型的篩選分析方法在微流體芯片上操作的可行性（包括結(jié)合分析、酶分析和細(xì)胞分析）已得到實驗論證。
　　Jiang等制造了2種可以用于高通量檢測食物污染物和進(jìn)行藥物篩選的微流體裝置。他們以硅為模板，采用模壓和毛細(xì)管成形技術(shù)在聚酯和多聚硅氧烷二甲酯中加工激流體網(wǎng)絡(luò)。在第1種裝置的微通道中夾著一塊PVDF（polyvinylidene fluoride）膜可用來結(jié)合、濃縮目標(biāo)化合物，然后再直接通過質(zhì)譜方法鑒定目標(biāo)化合物。第2種裝置被用來超濾分離本巴比妥和苯巴比妥與抗體的復(fù)合物。整個過程包括上樣、清洗和解離都是連續(xù)進(jìn)行的。這些微流體裝置不僅可以顯著降低系統(tǒng)死體積和所需樣品量，而且與先前報道的方法相比靈敏度至少可提高 1～2個數(shù)量級。
　　Capliper Technologies公司設(shè)計的芯片裝置，將從微孔板中取樣與隨后進(jìn)行的酶抑制劑篩選結(jié)合在一起。目前，該芯片裝置已制作完成，并通過了測試。測試的化合物通過與芯片相連的硅毛細(xì)管注射入芯片中，與酶及熒光酶底物混合以使它們在主反應(yīng)通道內(nèi)發(fā)生相互作用。酶與熒光底物反應(yīng)產(chǎn)生基線熒光信號。如果測試化合物抑制酶的活性，信號將會暫時性的降低，通過檢測熒光信號的強(qiáng)度就可以測定化合物抑制酶的活性。這種裝置每次進(jìn)樣量 1～10nL，進(jìn)樣同期10～30s。利用這個系統(tǒng)，每塊芯片可對幾千種化合物進(jìn)行篩選。目前對該系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)的努力主要集中在提高系統(tǒng)的耐用性和將不同類型的篩選方法移植到這個平臺上來。最新設(shè)計的微流體芯片將液體分發(fā)�；�合物稀釋與篩選分析 3者集成起來，由于減少了被視為瓶頸的芯片使用前的準(zhǔn)備步驟，使得該系統(tǒng)更加方便實用。
目前，致力于開發(fā)微流體芯片技術(shù)并將其應(yīng)用于藥物篩選的公司有：Caliper Technologies，Orchid
　　BioSciences，ACLARA BioSciences，Li－Cor等。

3 生物芯片在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用
　　對藥物進(jìn)行毒性評價，是藥物篩選過程中十分重要的一個環(huán)節(jié)。現(xiàn)在毒理學(xué)家多采用鼠為模型通過動物實驗來確定藥物的潛在毒性。這些方法需要使用大劑量的藥物，花上幾年時間，花費巨大。 DNA芯片技術(shù)可將藥物毒性與基因表達(dá)特征聯(lián)系起來，通過基因表達(dá)分析便可確定藥物毒性，使得藥物毒性或不期望出現(xiàn)的效應(yīng)在臨床實驗前得以確認(rèn)。用DNA芯片可以在一個實驗中同時對成千上萬個基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為研究化學(xué)或藥物分子對生物系統(tǒng)的作用提供全新的線索。該技術(shù)可對單個或多個有害物質(zhì)進(jìn)行分析，確定化學(xué)物質(zhì)在低劑量條件下的毒性，分析、推斷有毒物質(zhì)對不同生物的毒性可比性。如果不同類型的有毒物質(zhì)所對應(yīng)的基因表達(dá)諾有特征性的規(guī)律，那么，通過比較對照樣品和有毒物質(zhì)的基因表達(dá)譜，便可對各種不同的有毒物質(zhì)進(jìn)行分類，在此基礎(chǔ)上通過進(jìn)一步建立合適的生物模型系統(tǒng)，便可通過基因表達(dá)港變化來反映藥物對人體的毒性。
　　已經(jīng)有不少研究工作表明，利用DNA芯片預(yù)測化合物毒性和對毒性物質(zhì)進(jìn)行分類是可行的。 Waring等用15種已知的肝毒性化合物處理大鼠。這些毒物將對肝細(xì)胞造成多種傷害，如DNA 損傷、肝硬化、肝壞死和誘發(fā)肝癌等。從大鼠肝臟中提取RNA，用DNA芯片作基因表達(dá)分析。通過將基因表達(dá)結(jié)果與組織病理分析和臨床化學(xué)分析的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者有很強(qiáng)的相關(guān)性。該結(jié)果表明，DNA芯片分析是一種可以用來分析藥物安全性和對環(huán)境毒物進(jìn)行分類的靈敏度較高的方法。在另一報道中他們用同樣的15種化合物作用大鼠的肝細(xì)胞，再用DNA芯片作基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示具有相似毒性機(jī)制的化合物所獲得基因表達(dá)譜具有相似性。Gerhold等給大鼠服用苯巴比妥和地塞米松等藥物，使用寡核苷酸芯片，檢測了大鼠肝組織中與藥物代謝、毒性和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)。最后，通過分析基因表達(dá)變化的結(jié)果就可以推測藥物代謝與毒性的情況。Bartosiewicz等則利用 DNA芯片對環(huán)境毒物進(jìn)行了檢測。
　　目前已有多種較為成熟的毒理學(xué)DNA芯片繼問世。美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院分子致癌機(jī)制實驗室的Barrett等人研制了一種名為ToxChip的 DNA芯片，可以靈敏的檢測有害化學(xué)物質(zhì)對人體基因表達(dá)的作用（http：//dir，niehs．nih．gov/dirlmc/ lmcmain．htm）；Gene Logic公司的產(chǎn)品Flow－thru Chip已經(jīng)試投入商業(yè)運用，可用以檢測藥物和毒物對生物體的影響，他們還建立了龐大的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，可以用于藥物靶點確認(rèn)和毒性預(yù)測（http：// www.genelogic．com/geneexp.asp）；Syngenta公司和AstraZeneca Pharmaceuticals公司的科學(xué)家設(shè)計制作了被稱為ToxBlot arrays的DNA芯片，其第代產(chǎn)品ToxBlot Ⅱ含有大約13000人的基因，包含了所有毒理學(xué)家感興趣的基因家族和信號通路；美國化學(xué)工業(yè)毒物研究所（Chemical Industry Insti tute of Toxicology）中專門有一個工作小組用微陣列 技術(shù)研究一些致癌毒物對人體的作用（http；// www．ciit．org/toxicogenomics/construction．html）

4 生物芯片在藥物基因組學(xué)中的應(yīng)用
　　藥物基因組學(xué)是在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上研究不個體對藥物反應(yīng)的差異以便針對不同的基因型"量身定做"藥物，從而將藥物的藥效充分發(fā)揮而不良反應(yīng)減少到最小。其優(yōu)點為：①在進(jìn)入臨床試驗前，藥物基因組學(xué)可以通過化合物對基因多態(tài)性的影響挑選先導(dǎo)物，從而降低由于藥效的不穩(wěn)定導(dǎo)致的失敗幾率。②在Ⅰ期臨床試驗中，個體基因型可以預(yù)見基因多態(tài)性造成的藥物代謝動力學(xué)差異。③由于藥物作用靶蛋白的差異反映在基因多態(tài)性上，因此在Ⅱ期臨床試驗中，由個體基因型可以預(yù)見基因多態(tài)性造成的藥效差異，由此來指導(dǎo)Ⅲ期臨床試驗 ④一旦發(fā)現(xiàn)一種可以導(dǎo)致藥物作用差異的蛋白，其他與之相關(guān)的蛋白可作為潛在的藥物作用靶。
　　將DNA芯片技術(shù)應(yīng)用于藥物基因組學(xué)，一方面可以加速藥物基因組學(xué)的發(fā)展，主要是利用DNA 芯片進(jìn)行基因功能及其多態(tài)性的研究，以確認(rèn)與藥物效應(yīng)及藥物吸收、代謝、排泄等相關(guān)的基因，并查明這些基因的多態(tài)性；另一方面DNA芯片利用藥物基因組學(xué)的研究成果，根據(jù)基因型將人分群，以實現(xiàn)藥物基因組學(xué)研究的目的和價值。從這兩方面足以看到DNA芯片技術(shù)對藥物基因組學(xué)研究的影響之大。
　　DNA芯片可以自動、快速地檢測那些可以影響藥物效應(yīng)的基因（如藥物代謝酶、藥物作用靶和致病因子的編碼基因）和決定個人對藥物毒性敏感性的基因。Evans和Relling就設(shè)想了一種急性原淋巴細(xì)胞白血病藥物基因組芯片，這種芯片上包括了所有可能影響急性原淋巴細(xì)胞白血病病人對化學(xué)治療反應(yīng)的基因，借助這種芯片可以根據(jù)病人的基因型對病人分群，幫助醫(yī)生為每個病人選擇合適的治療藥物和藥物劑量。

5 生物芯片在藥物分析中的應(yīng)用
　　生物芯片在藥物分析中的應(yīng)用主要是指采用毛細(xì)管電泳芯片/質(zhì)譜系統(tǒng)對化合物庫、血樣和尿樣中的藥物進(jìn)行分析鑒定。毛細(xì)管電泳芯片/貢譜系統(tǒng)是指將毛細(xì)管電泳芯片和質(zhì)譜聯(lián)用的一套裝置。毛細(xì)管電泳芯片進(jìn)行樣品的分離，而與芯片聯(lián)用的質(zhì)譜則有選擇性的對分離成分進(jìn)行檢測。美國康奈爾大學(xué)的Wachs等發(fā)明了一種微型化的離子噴霧裝置。這種裝置適合于與基于芯片的分離裝置、多孔板或帶有待測樣品殘渣的表面聯(lián)用。這種裝置有兩種版本，一種稱為微型噴霧器，主要與毛細(xì)管電泳芯片聯(lián)用；另一種稱為小型噴霧器，它帶有伸長的吸樣毛細(xì)管，可以插入多孔板孔的底部，所以適合與多孔板聯(lián)用。這種裝置可以幫助人們對芯片分離所得樣品或多孔板中樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測。來自康奈爾大學(xué)同一個實驗室的Deng等將玻璃制成的毛細(xì)管電泳芯片與他們自己設(shè)計的微型離子噴霧裝置連接，使用PE公司的質(zhì)譜系統(tǒng)做檢測，對多種藥物的標(biāo)準(zhǔn)和血漿樣品進(jìn)行了分析檢測。實驗結(jié)果證明，使用毛細(xì)管電泳芯片/質(zhì)譜系統(tǒng)對小分子化合物進(jìn)行快速（30s）的檢測是可行的。這套裝置可以用來對合成的化合物庫和人血漿中重要成分進(jìn)行分析檢測。Ramseier等用芯片毛細(xì)管電泳和使膠毛細(xì)管電泳檢測尿中苯丙胺及其類似物，實驗結(jié)果顯示芯片毛細(xì)管電泳的方法具有更快的分高速度和更高的分離效率。Chiem等則用毛細(xì)管電泳芯片檢測了血清中的茶堿。

6 結(jié)語
　　隨著一浪高過一浪的生物芯片技術(shù)研發(fā)熱潮，生物芯片技術(shù)在藥物研究與開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用也將更廣泛更深入。特別值得一提的是，在今天"回歸自然"思潮的影響下，天然藥物的開發(fā)成為一股強(qiáng)大的潮流，而中藥又以其豐富的資源、獨特的療效、較小的不良反應(yīng)引起世界的關(guān)注；同時人們也認(rèn)識到，從化學(xué)合成物中篩選新藥難度大、費用高、周期長，于是中藥的研究與開發(fā)已成為新藥研發(fā)的熱點。中藥現(xiàn)代化研究的難點就在于中藥成分的復(fù)雜性和中藥作用機(jī)制的復(fù)雜性。生物芯片由于具有高通量（或超高通量）、并行性、低消耗、微型化、自動化的特點，將尤其適合于中藥的研究與開發(fā)。例如香港城市大學(xué)的生物芯片研究小組就利用DNA微陣列芯片研究了中藥對腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的影響；他們還致力于開發(fā)能對中藥有效成分進(jìn)行分離和篩選的生物芯片系統(tǒng)。香港理工大學(xué)的的研究小組采用DNA芯片對中藥進(jìn)行基因分型，從而鑒定中藥的品種。生物芯片北京國家工程研究中心采用自行研制的酵母全基因組DNA芯片，與北京大學(xué)藥學(xué)院生物技術(shù)室合作研究了多種抗真菌中藥的作用機(jī)制�？梢灶A(yù)見，生物芯片技術(shù)將在中藥現(xiàn)代化研究與開發(fā)中大顯身手。
　　隨著中國加入WTO日程的日益臨近，我國的制藥工業(yè)面臨著知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)的強(qiáng)大壓力。加緊研究開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的藥物已迫在眉睫。目前國外幾乎所有的大制藥公司都不約而同地采用了生物芯片技術(shù)。我國在該領(lǐng)域雖然起步較晚，但潛力較大，以此作為突破口，將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于創(chuàng)新藥物的研究與開發(fā)以及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究將一定能夠取得令人矚目的成績。
　　（生物芯片北京國家工程研究中心，鄧沱，程京）（清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系，鄧沱，周玉祥，程京）