MCE類器官培養(yǎng)基產(chǎn)品上新，邀您免費申領(lǐng)試用裝

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圖9. 類器官構(gòu)建、培養(yǎng)、傳代流程。
a、類器官構(gòu)建全流程示意圖；
b、洗滌后狀態(tài)對比：無類器官殘留(左)、存在BME殘留(中)、可見完整類器官(右)；
c、12孔板中BME液滴分布圖(比例尺：5 mm)；
d、BME與基質(zhì)膠培養(yǎng)體系下乳腺類器官形態(tài)對比，兩者生長狀態(tài)相似 (比例尺：100 μm)；
e、單細胞傳代與5-20個細胞團傳代后類器官生長情況 (比例尺：100 μm)；
f、含有細胞碎片的類器官培養(yǎng)圖像 (比例尺：100 μm)；
g、不同接種密度下類器官生長狀態(tài)：密度過低 (左)、過高 (中)、適宜 (右)(比例尺：100 μm)；
h、傳代時機判斷：類器官呈匯總狀 (左) 或類葡萄狀 (右) 時可進行傳代 (比例尺：100 μm)。

為降低實驗過程中粘附損失，所有耗材 (如玻璃培養(yǎng)皿、吸管、Falcon 管、細胞篩) 均需使用 D-BSA (500mL DMEM GlutaMAX 含有 5mL 雙抗 (P/S) 5mL10% BSA，BSA 粉末溶于 DPBS) 溶液預(yù)潤洗。

組織來源乳腺癌類器官構(gòu)建^[1]

(1) 組織保存與樣本留樣

新鮮組織樣本需置于含100 μg/mL Primocin?的adDMEM/F12⁺⁺⁺ (Advanced DMEM/F12 中添加 5 mL 雙抗，5 mL GlutaMAX 和 5 mL HEPES) 培養(yǎng)基中。4℃ 保存不超過 72 h。同時，應(yīng)進行系統(tǒng)化樣本留樣，以備后續(xù)分析：

• 形態(tài)學(xué)記錄：對組織大小、脂肪含量、血管浸潤及壞死區(qū)域等進行拍照存檔。
• DNA 樣本：取 2-4 mm³ 組織片段，經(jīng) 70% 乙醇清洗后，干冰速凍并于 -20℃ 保存。
• HE 染色樣本：將等量組織塊固定于 5 mL 4% 福爾馬林中。
• 多組學(xué)樣本：取等量組織塊，干冰速凍后轉(zhuǎn)入 -80℃ 保存，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組及蛋白組學(xué)分析。

 
(2) 組織消化

使用手術(shù)刀將組織剪切至約 0.5-1 mm³的碎塊，轉(zhuǎn)移至 50 mL Falcon 管中，先后用 D-BSA 溶液清洗兩次以去除雜質(zhì)。棄上清后，加入10 mL Type 1 (配方見表 1)培養(yǎng)基，并補充 500 μL 膠原酶 (1g 溶于 50 mL adDMEM/F12⁺⁺⁺，0.22 μm 濾膜過濾，使用終濃度 1 mg/mL) 及10 μL ROCK 抑制劑 (10 mg 粉末溶于 312 μL DMSO 中，使用終濃度 10 μM)。管口封膜后，置于 37℃ 搖床 (140 rpm) 消化 1-2 h。消化時間需根據(jù)組織類型 (正常/腫瘤)、大小及狀態(tài)靈活調(diào)整 (正常組織一般需要 2 h，腫瘤組織一般需要 0.5-2 h)。

(3) 終止消化

消化結(jié)束后，加入 1 mL FBS 終止反應(yīng)，并用 D-BSA 預(yù)潤洗的吸管輕柔吹打混勻。

(4) 過濾與清洗

使用 100 μm 細胞篩過濾消化產(chǎn)物 (不更換濾篩以減少損失)。濾液經(jīng) 450 g、8℃ 離心 5 min 后棄上清，剩余約 4 mL 液體轉(zhuǎn)至 15 mL 管，加入 10 mL D-BSA 重懸清洗，再次離心后小心吸棄上清，保留約 1 mL 液體。

(5) 裂紅 (可選步驟)

若沉淀呈紅色，可加入 1-2 mL 紅細胞裂解液，室溫孵育 2 min。

注意：溶液中組織樣本＜100 μL，使用 1 mL 紅細胞裂解液，樣本＞100 μL，使用 2 mL 紅細胞裂解液。

(6) 細胞懸液制備

向沉淀中加入10 mL D-BSA 清洗離心后，吸棄上清，根據(jù)沉淀體積按比例加入基底膜提取物 (basement membrane extract , BME)(通常按 50 μL 沉淀加入 200 μL BME 的比例) 進行重懸。

注意：此步驟需保持低溫操作，防止 BME 提前固化；若懸液黏稠，可使用剪去尖端的平口槍頭吹打。

(7) 點膠固化

在 12 孔板中分滴滴加細胞 -BME 混合懸液 (每滴<20 μL)，每孔總量 100 μL 。將培養(yǎng)板倒置于 37℃ 培養(yǎng)箱中固化 30 min，以防止細胞沉淀至孔板底部。

注意：當組織生長量受限時可選擇不同的培養(yǎng)耗材來提高，具體使用量見表 2。

(8) 培養(yǎng)與維持

固化后，分別加入750 μL Type 1 與 Type 2 擴增培養(yǎng)基 (配方見表 1)。將培養(yǎng)板繼續(xù)倒置，置于 37℃、5% CO₂ 條件下培養(yǎng)。每 2-4 天更換培養(yǎng)基，并定期在明場顯微鏡下觀察類器官生長狀態(tài)并拍照記錄。若初始組織量有限，可參考表 2 調(diào)整培養(yǎng)耗材規(guī)格。

表. 不同規(guī)格培養(yǎng)皿使用 BME 的體積