學術會議通知：三維微重力旋轉式細胞組織培養(yǎng)系統(tǒng)

根據中國有關用戶的要求，美國宇航局生命技術中心的Roger Akers將在北京作三維微重力旋轉式細胞組織培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS生物反應器）應用情況的報告，歡迎大家報名。報名方式：info@EQUL.com

曰期 : 2001年10月30日
時 間: 下午1點至下午4點
地 點: 北京市

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會議主題：三維微重力旋轉式細胞組織培養(yǎng)技術的最新進展

體內組織的生長發(fā)育過程是在一定的內環(huán)境條件下進行的，常規(guī)的體外單層培養(yǎng)方法不能提供組織正常生長發(fā)育所需的環(huán)境條件，通常的后果是細胞發(fā)生分化現(xiàn)象，培養(yǎng)的細胞不僅失去了正常的形態(tài)，而且失去了其生化與功能性質。比如，軟骨細胞在單層培養(yǎng)過程中，呈現(xiàn)出類似成纖維細胞的形態(tài)，并且由正常條件下的分泌Ⅰ型膠原轉變到分泌Ⅱ型膠原，這一形態(tài)與功能變化與培養(yǎng)條件有關［12］。因而需要通過培養(yǎng)系統(tǒng)技術對環(huán)境因子進行有效的控制。培養(yǎng)系統(tǒng)能提供以下基本性能：
(1)對培養(yǎng)液進行有效的、均一的混合并對傳質過程進行精確控制；
(2)調節(jié)培養(yǎng)容器中的剪應力大小；
(3)維持恒定的pH值、氣體分壓及營養(yǎng)物質的濃度；
(4)通過過程控制以滿足培養(yǎng)物在生長發(fā)育過程中對環(huán)境條件的不同需求。然而，不同于普通的用于大規(guī)模生產基因工程產物的反應器(容積可高達105升)，用于組織工程的培養(yǎng)系統(tǒng)的設計原則是通過模擬在體的內環(huán)境條件，提供工程組織生長發(fā)育所需的必要的生化條件，以及針針不同的組織提供細胞分化所需的特殊條件(容積一般不大于0.5升)。實現(xiàn)這一目的除了要求提供足夠大的傳質速率以保證細胞的生長外，還需要根據所培養(yǎng)的組織類型，在反應器的設計上模擬組織生長發(fā)育的微環(huán)境狀態(tài)，促進不同細胞的分化。

與單層培養(yǎng)相比，三維組織培養(yǎng)通常含有很高的細胞密度，因而需要頻繁地換液以保持營養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，因此，在培養(yǎng)系統(tǒng)設計中，通常采用灌注培養(yǎng)方式來維持pH值和營養(yǎng)物質的穩(wěn)定，這種培養(yǎng)方式也避免了在對工程組織的長期培養(yǎng)過程中，由于換液操作而帶來的污染風險［13］。

高密度細胞培養(yǎng)常常受到營養(yǎng)物質和氧氣供應不充分的限制，為了滿足培養(yǎng)環(huán)境中對高傳質速率的需要，對培養(yǎng)槽需要進行特殊的設計。早期的工作曾應用機械攪拌等方式，對貼附在微載體上的細胞進行懸浮培養(yǎng)來維持足夠的傳質效率。雖然通過對攪拌槳形狀的正確設計，添加保護劑等措施可以降低由攪拌引起的強剪應力對細胞造成的損傷，因而可用于生物制藥的目的。然而這種混合方式除了產生了強剪應力外，還造成營養(yǎng)物質與pH值的梯度，這種生化環(huán)境條件對組織的生長發(fā)育產生不利的影響，因而不適用于工程組織的培養(yǎng)。

如何有效地控制反應器中的傳質過程是組織工程用培養(yǎng)系統(tǒng)的技術難點。利用二次流是解決問題的一個途徑，通過增加內部流體的循環(huán)，傳質速率大大提高。而由美國宇航局設計的旋轉細胞培養(yǎng)儀（www.EQUL.com)，具有不同的混合方式［14］。通過外部的旋轉方式，在低剪應力的條件下，旋轉所產生的流動可以實現(xiàn)對培養(yǎng)成分充分的混合，并使一定大小之內的培養(yǎng)物以懸浮狀態(tài)存在。在這種培養(yǎng)條件下，人肺腺癌細胞可與微載體形成0.2～0.5 cm的聚集體并具有顯著的分化特性［15］。這一技術已應用于人工軟骨等多種組織的三維培養(yǎng)［16］。

References:

［11］Freed LE, Vunjak-Novakovic G, Langer R. Cultivation of cell-polymer cartilage implants in bioreactors. J cell Biochem, 1993; 51(3)∶257
［12］Aulthouse Al, Beck M, Griffey E et al. Expression of the human chondrocyte phenotype in vitro. In Vitro Cell Dev Biol, 1989; 25(7)∶659
［13］Sittinger M, Schultz O, Keyszer G et al. Artificial tissues in perfusion culture. Int J Artif Organs, 1997; 20(1)∶57
［14］Tsao YD, Goodwin TJ, Wolf DA et al. Responses of gravity level variations on the NASA/JSC bioreactor system. Physiologist, 1992; 35(1Suppl)∶S49
［15］Goodwin TJ, Jessup JM, Wolf DA. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol, 1992; 28A(1)∶47
［16］Freed LE, Hollander AP, Martin I et al. Chondrogenesis in a cell-polymer bioreactor system. Exp Cell Res, 1998; 240(1)∶58


[1] 大量培養(yǎng)細胞的意義：

動物和人的細胞可以合成有重要價值的蛋白質（例如干擾素、單克隆抗體等等），在科研、臨床和商業(yè)上都有重大價值。要制備干擾素、單抗、尿激酶等，就需要大量培養(yǎng)哺乳動物的細胞、人的雜交瘤骨髓瘤細胞、人的腎細胞等等。雖然工業(yè)微生物技術已發(fā)展很完善，但是它主要是用于培養(yǎng)細菌類的細胞，它們有堅韌的細胞壁，對營養(yǎng)物質的要求較簡單。而哺乳類細胞則大而脆弱，對營養(yǎng)物質要求高，不能游離生活，大多數要附著在某種表面才能生長。要大量培養(yǎng)哺乳類細胞是個困難的任務。

[2] 大量培養(yǎng)細胞的方法：

小的細胞培養(yǎng)瓶，瓶底面積很小，只能培養(yǎng)很少細胞，要不斷分瓶，得用許多長的瓶子不斷滾動來獲得較多的細胞。后來，人們又采取高密度培養(yǎng)方法，以求在一定的容積內能培養(yǎng)更多的細胞。對于要求附著生長的細胞，為提高表面積/ 體積的比值，用空心纖維和微載體作為附著物，可以大大提高培養(yǎng)容積的利用率。
微珠作為載體，是提高培養(yǎng)密度的有效方法，細胞可以生長在微珠的表面，微載體法，可使在同樣容積內培養(yǎng)細胞數增加幾個量級。隨著細胞的生長，附近的營養(yǎng)物質逐漸減少，廢物逐漸增多，為了使生長的細胞不斷接觸到營養(yǎng)物質，并離開廢物，微珠能在培養(yǎng)介質中分散和懸浮，并且不斷供應培養(yǎng)液，不斷排出廢液。

[3] 綜述：

一項拯救生命的技術
用于培養(yǎng)組織和器官的技術
用于替代實驗動物和人的組織的技術

----- 細胞組織 在微重力環(huán)境下進行的 三維的高分化度培養(yǎng)技術

I. 【該項拯救生命的技術的意義】
0.重組蛋白制藥: 效率是其它培養(yǎng)方法的10倍。
1.在軟骨再生中：RCCS培養(yǎng)出來的軟骨密度很高，可以用在損傷和關節(jié)炎的治療中。
2.在疫苗生產中：目前的丙肝疫苗效果不佳的部分原因是用來產生這種疫苗的病毒不是長在人的肝臟中，而RCCS培養(yǎng)出來的肝臟在病理學家的看來和正常人的肝臟沒有什么區(qū)別，使得產生肝炎疫苗的病毒生長在人的肝臟成為現(xiàn)實。在美國這項技術已廣泛用于生產。
3.在激素、酶和其它只有由人體組織產生的蛋白以及基因工程的研究和生產中：我們現(xiàn)在可在實驗室或工廠中生產分化的人體組織，其被刺激后能分泌治療用的蛋白。例如，經培養(yǎng)的神經組織產生的神經生長激素將使脊椎的損傷得到修復。
4.在骨髓再生中：在RCCS中，骨髓生長情況極佳，且可連續(xù)進行增生和低溫冷凍保藏。這意味著在技術上建立全國性骨髓庫已經成為可能。每個急性外傷中心的死亡事件都能產生一個潛在的骨髓捐贈者，每年的這種事件無數就使得幾千種類型骨髓可以得到生長和冷凍，從而建立全國性的骨髓庫。
5.在使糖尿病人不必長期注射胰島素的工作中：產生胰腺細胞的胰島素培養(yǎng)后能插入糖尿病人體內繼續(xù)生長。這樣，無數的病人有望免去長期注射胰島素的煩惱。
6.在腫瘤的研究和治療中：
A. 有效地殺滅腫瘤：RCCS中培養(yǎng)后，感化了的淋巴細胞能徹底殺滅腫瘤組織。例如，對于膀胱癌病人，醫(yī)生對病人的腫瘤組織進行活體取樣，與其自身免疫系統(tǒng)的白細胞或淋巴細胞在RCCS中進行混合培養(yǎng)，刺激或訓練這些免疫系統(tǒng)的細胞來識別和攻擊腫瘤組織，然后把這些經訓練后有殺傷力的細胞直接注入病人的腫瘤組織中。這樣，這些經感化的淋巴細胞徹底殺滅了腫瘤。
B. 建立最理想的腫瘤模型：人體腫瘤組織的培養(yǎng)為測試化療藥在病人自身的經培養(yǎng)和分化的腫瘤上的療效奠定了基礎，決定化療藥成分的有效性，從而避免了化療藥的盲目使用。以前這些試驗是在鼠的組織模型上進行的，但由于物種差異，人的許多腫瘤在鼠中的生長情況并不好，如最好的結腸腫瘤的移植率才為60％，而乳腺腫瘤為8－10％，前列腺腫瘤為0。但在RCCS中，結腸、乳腺、前例腺、卵巢、肺和腦等其它腫瘤組織都能得到很好的生長。至今沒有見到在RCCS中腫瘤組織是不生長的。而且，這些腫瘤模型避免了以前鼠蛋白的干擾。
7.建立最理想的AIDS/HIV模型：在美國國立衛(wèi)生研究院中有50臺RCCS用來進行組織研究。以前研究者很難對HIV的感染者進行早期的跟蹤，因為病人常常在被診斷出的幾年前已經感染了該病毒。而且跟蹤研究需要大量的樣本，病人不愿讓研究者經常進行活體取樣，這是可理解的�，F(xiàn)在有了RCCS，研究者可培養(yǎng)正常人的器官、腺體和淋巴結。他們用HIV來感染這些類器官，然后跟蹤HIV的生長。AZT已被證明在已感染的病人和這些被感染的類器官上具有相同的效果。現(xiàn)在研究者把其它的HIV藥物用在被HIV感染的RCCS培養(yǎng)出來的組織模型上，從而研究它們對抗HIV的效果及其對抗方式。
8.在組織移植中：例如，RCCS培養(yǎng)出來的肝臟在病理學家的看來和正常人的肝臟沒有什么區(qū)別，使得目前進行局部的肝臟組織移植成為可能。
9.在皮膚移植中：在RCCS誕生之前，用普通的組織培養(yǎng)裝置的產物來進行皮膚組織移植已有好幾年了。然而，以前培養(yǎng)出來的皮膚無論在肌理和靈巧度上，還是在膚色上，與真皮都有很大的差距。用RCCS培養(yǎng)出來的皮膚具有極高分化度，其外觀和感覺可以亂真。

II.【發(fā)明的起因】NASA在研究可在宇宙間培養(yǎng)細胞并且返回到地球時細胞仍能成活的裝置的同時發(fā)明了旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary Cell Culture System 即RCCS)，她使得生物學家可以在地球上進行體外培養(yǎng)復雜的人及其它哺乳動物的組織。RCCS在98年11月隨"發(fā)現(xiàn)號"航天飛機一起遨游太空。

III.【與類似產品根本區(qū)別】大家知道，普通的細胞和組織培養(yǎng)裝置已有100多年的歷史，RCCS 為何如此引人注目呢？是什么使她比普通的培養(yǎng)裝置優(yōu)越呢？有三大理由：
(1)高分化度。分化是指當細胞組織被再生時，其扮演不同的角色來模仿人體中同樣的組織結構和功能。即肝組織代謝毒素和分泌膽汁，骨髓產生血細胞和血小板，胰島產生胰島素，腫瘤組織增長瘋狂。有了這項發(fā)明，分化的人體組織能在實驗室中生長，用來模仿科學家們感興趣的器官和腫瘤。
(2)模擬微重力。以前要想在體外模擬正常組織的微環(huán)境由于細胞外基質的復雜性和對環(huán)境的適應性而受阻，而此細胞外基質對于調節(jié)細胞骨架和細胞核基質蛋白是很重要的。重力就是問題之一，它將分裂原本應在一起的細胞組織成分，而RCCS解決了這個問題。
(3)完善的三維細胞培養(yǎng)。一般的生物反應器依賴的方法是保持細胞的懸浮從而導致剪切力的產生. 這剪切力使細胞間和細胞與基質間的穩(wěn)定性遭到破壞。 這樣組織和細胞集中于自身的修復, 從而大大影響其生長和其它的正常生理功能。
大家知道, 培養(yǎng)大量細菌采用發(fā)孝罐, 現(xiàn)在人們往往把發(fā)孝罐也拿來培養(yǎng)細胞和組織，但結果卻不理想。原因是發(fā)孝罐不是為此而設計的, 發(fā)孝罐對于人及其它哺乳動物細胞組織的培養(yǎng)不合適的原因主要是很難把大量的細胞移植到發(fā)孝罐中, 即使能夠培養(yǎng), 所得的細胞數也有限, 且很難生成組織。而RCCS解決了這個問題，它對細胞和組織培養(yǎng)是最理想的, 而且可以用于大規(guī)模生產。這主要是因為在RCCS中細胞的成活率平均可達97%, 并且細胞的分化程度是其它裝置所不可比擬的。

IV.【RCCS系統(tǒng)介紹】RCCS是非常精巧的，其圓柱狀的組織培養(yǎng)容器中充滿了用作培養(yǎng)基的生長液，同時加入細胞或組織材料。整個容器由電機驅動，沿水平軸旋轉。細胞或組織顆粒在水平軸內建立一個均質的液體懸浮軌道。培養(yǎng)基以及細胞和組織顆粒隨容器一起旋轉且不與容器壁和其它任何東西相撞。由于系統(tǒng)無推進器、空氣升液器、氣泡或攪拌器，使得破壞性的應力減到最小。RCCS中的細胞通過一個如人工肺膜式氣體交換器來吸收氧氣和排出二氧化碳。任何可能產生的氣泡都被清除，因為即使有極少的旋渦，細胞的生長也會受到影響。破壞應力的去除使得生成的三維組織具有與父系組織相同的結構和功能。在RCCS中組織的培養(yǎng)密度可達10E10至10E11個細胞/ml；而細胞的培養(yǎng)密度達10E8。至今還沒有發(fā)現(xiàn)有哪一種類型的細胞或組織在RCCS中生長不成功的并且已有幾百種類型得到生長。在全世界已有2000多臺RCCS，其中包括在中國。